细胞培养技术ppt课件

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1、细胞培养技术1参考书目细胞培养，世界图书出版公司，1996年培养细胞学与细胞培养技术 ，上海科学技术出版社，2004年2本次课内容细胞培养的基本知识一、绪论 培养法的种类、培养法的发展、细胞培养的常用术语、培养细胞的作用及意义、培养法的应用二、培养细胞的特征 培养细胞的生长方式和类型、 培养细胞的生长特点和生长增殖过程、 细胞培养的条件及影响因素3一、绪论4细胞培养技术是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。 即：从活体中取出小块组织分离出细胞，在一定条件下进行培养，使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。涉及有细胞生物学、生物化学与分子生物学、动物学与植物学、病原学、肿瘤学、

2、遗传学、生物工程学甚至光学、物理学等等学科。因其涉及面很广所以已经渗透到生命科学的各个领域。细胞培养（细胞培养（cell culture) )5组织培养的概念组织培养（tissue culture）： 其本意是指从体内取出组织和细胞，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。6器官培养（Organ culture）： 指的是应用和组织培养相似的条件，培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法，以上三个层次的培养，又可统称之为体外培养（in vitro）。7培养法的种类体外培养 细胞培养 组织培养 器官培

3、养贴壁培养悬浮培养8体体外外培培养养种种类类9细胞培养可分为群体培养和克隆培养两种。细胞培养可分为群体培养和克隆培养两种。群体培养（群体培养（mass culture）：即将大量细胞置于培）：即将大量细胞置于培养瓶中，让其贴壁或悬浮生长，形成均匀的单层细养瓶中，让其贴壁或悬浮生长，形成均匀的单层细胞或单细胞悬液。胞或单细胞悬液。克隆培养（克隆培养（clone culture）：即将少数细胞加入培）：即将少数细胞加入培养瓶中，贴壁后彼此间隔距离较远，经过繁殖每一养瓶中，贴壁后彼此间隔距离较远，经过繁殖每一个细胞形成一个集落，称为克隆。个细胞形成一个集落，称为克隆。10群体培养（左）和克隆培养（右

4、）群体培养（左）和克隆培养（右） 11原代培养第原代培养第4天，成纤维样细胞散布于培养瓶底，天，成纤维样细胞散布于培养瓶底，个别集落形成，细胞围绕中心漩涡状排列个别集落形成，细胞围绕中心漩涡状排列10012原代培养第原代培养第7天，多个集落形成并融合天，多个集落形成并融合100 13培养法的发展组织培养法的发展经历近百年。德国人Roux（1885）用温生理盐水体外培养鸡胚组织并存活数月被认为是组织培养的萌芽试验。1903年Jolly用盖片悬滴培养法，培养蝾螈白细胞生活一个月，提示组织或细胞离体后，在人工培养条件下，仍能生存。14培养法的发展关于神经轴突的结构和形成有争议。哈里森（生理学家）首先

5、解剖了蛙胚的原始脊髓节段在淋巴液中进行培养。在显微镜下观察到从神经芽细胞延伸出神经轴突的状况。建立起一套合理的无菌培养技术 哈里森悬滴培养法哈里森悬滴培养法15哈里森悬滴培养法培养物凝固的淋巴凹玻片槽盖玻片 将蛙胚原始脊髓节段，移到事先滴有从成体蛙淋巴囊吸取的新鲜淋巴将蛙胚原始脊髓节段，移到事先滴有从成体蛙淋巴囊吸取的新鲜淋巴将蛙胚原始脊髓节段，移到事先滴有从成体蛙淋巴囊吸取的新鲜淋巴将蛙胚原始脊髓节段，移到事先滴有从成体蛙淋巴囊吸取的新鲜淋巴的盖玻片上，的盖玻片上，的盖玻片上，的盖玻片上， 淋巴很快凝固，使组织小块固定在一定的位置上。淋巴很快凝固，使组织小块固定在一定的位置上。淋巴很快凝固，

6、使组织小块固定在一定的位置上。淋巴很快凝固，使组织小块固定在一定的位置上。 然后将盖玻片倒置于一块中央凹陷的厚载玻片上，盖玻片的周缘用蜡然后将盖玻片倒置于一块中央凹陷的厚载玻片上，盖玻片的周缘用蜡然后将盖玻片倒置于一块中央凹陷的厚载玻片上，盖玻片的周缘用蜡然后将盖玻片倒置于一块中央凹陷的厚载玻片上，盖玻片的周缘用蜡封固。封固。封固。封固。 蛙胚神经组织存活了数周蛙胚神经组织存活了数周蛙胚神经组织存活了数周蛙胚神经组织存活了数周体外培养组织和细胞的基本模式系统。体外培养组织和细胞的基本模式系统。体外培养组织和细胞的基本模式系统。体外培养组织和细胞的基本模式系统。16卡氏瓶的发明Carrel用反复

7、传代的方法使细胞系存活34年。他采用的无菌技术，以及后来设计的培养瓶（卡氏瓶，Carrel flask）等都是对组织培养的重要贡献。特别是他的连续培养，为后来的传代培养奠定了基础。17组织培养发展示意图组织培养发展示意图 19231923年，年，CarrelCarrel设计设计了卡式瓶培养法，扩了卡式瓶培养法，扩大了组织的生存空间。大了组织的生存空间。19241924年年MaximowMaximow的双盖的双盖片培养法，使之更易片培养法，使之更易于传代和减少污染。于传代和减少污染。181957195719571957年年年年Dulbecco Dulbecco Dulbecco Dulbecco

8、 等采用胰蛋白酶消化处理和应用等采用胰蛋白酶消化处理和应用等采用胰蛋白酶消化处理和应用等采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基的方法，获得了的单层细胞培养，单液体培养基的方法，获得了的单层细胞培养，单液体培养基的方法，获得了的单层细胞培养，单液体培养基的方法，获得了的单层细胞培养，单层培养成了组织培养普遍应用的技术。促进了细层培养成了组织培养普遍应用的技术。促进了细层培养成了组织培养普遍应用的技术。促进了细层培养成了组织培养普遍应用的技术。促进了细胞系胞系胞系胞系(cell line)(cell line)(cell line)(cell line)的建立。的建立。的建立。的建立。近年各种条件已

9、商品化系列化，应用冷冻技术，近年各种条件已商品化系列化，应用冷冻技术，近年各种条件已商品化系列化，应用冷冻技术，近年各种条件已商品化系列化，应用冷冻技术，各国建立细胞库各国建立细胞库各国建立细胞库各国建立细胞库 19我国组织培养的发展我国组织培养的发展20202020世纪世纪世纪世纪30303030年代传入我国。年代传入我国。年代传入我国。年代传入我国。20202020世纪世纪世纪世纪50505050年代起步。年代起步。年代起步。年代起步。20202020世纪世纪世纪世纪70707070年代，成为医学和生物学研究年代，成为医学和生物学研究年代，成为医学和生物学研究年代，成为医学和生物学研究中应

10、用的手段。中应用的手段。中应用的手段。中应用的手段。20组织培养常用术语组织培养常用术语 原代培养（原代培养（primary culture）：从直接）：从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。 传代培养（传代培养（passage culture）：将细胞）：将细胞以一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶以一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代培养。即称为传代培养。 注：传代（注：传代（passage，subculture）21原代培养胎儿细胞培养比成人容易；成体组织中成纤维细胞、肾上皮细胞比较容易，上皮细胞培养难。细胞间的分离酶：胰蛋白酶、胶原酶、

11、单一种类细胞的分离培养：根据培养条件培养基、细胞接着面的条件、接着速度、离心法等。22细胞系（细胞系（cell line）：原代培养经）：原代培养经首次传代成功首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的后即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。细胞世系所组成。细胞株（细胞株（cell strain）：通过选择法或克隆形成）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的法从原代培养物或细胞系中获得的特殊性质或特殊性质或标志标志，并能，并能稳定保持稳定保持这些这些特性特性的培养物。的培养物。克隆（克隆（clone）：指）：指单个细胞单个细胞通过有丝分裂所产通过有丝分裂

12、所产生的遗传性状相同的细胞群体。生的遗传性状相同的细胞群体。23有分化特性的细胞系和细胞株有分化特性的细胞系和细胞株组织来源来源细胞系胞系增殖性增殖性物种物种分化特性分化特性脾脾Friend永生永生小鼠小鼠合成血红蛋白合成血红蛋白Morris肝癌肝癌HTC永生永生 大鼠大鼠酪氨酸转移酶诱导酪氨酸转移酶诱导髓性白血病髓性白血病K562永生永生人人合成血红蛋白合成血红蛋白垂体瘤垂体瘤GH2,GH3永生永生大鼠大鼠产生生长激素产生生长激素黑色素瘤黑色素瘤B16永生永生小鼠小鼠产生色素产生色素髓性白血病髓性白血病HL60永生永生人人合成球蛋白合成球蛋白胶质瘤胶质瘤CCM永生永生人人胶质纤维酸性蛋白胶质

13、纤维酸性蛋白成神经细胞瘤成神经细胞瘤C1300永生永生大鼠大鼠生长轴突生长轴突24对细胞培养技术的评价优点优点：1、活细胞： 能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动；2、可控制： 选择对象：均一性、重复性（类型、性质、阶段） ； 调节条件：各种因素（物理、化学、生物等因素）； 利用方法：研究技术、记录方法；3、应用广： 领域多：医学研究、生物技术、基因工程等 对象广：各种动物（低等动物-高等动物-人类） 一种动物（不同年龄、不同组织） 正常或异常（肿瘤）4、较经济： 可提供大量、同时、重复性好的、生物学性状相似的实验对象；25缺点：缺点： 1、培养细胞会发生改变； 2、对人员、设

14、备等要求较高。与体内主要不同 相对孤立、相对单一、缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响。 主要表现 失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱、细胞趋向单一化。 提示 要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。对细胞培养技术的评价26细胞培养技术的研究、观察内容细胞内活动细胞内活动：例如能量的代谢、DNA转录、凋亡及蛋白合成等。细胞内部与细胞外界之间的作用细胞内部与细胞外界之间的作用：如细胞对外界刺激的反应、药物对细胞的作用、细胞内产物的分泌等。细胞间的相互作用细胞间的相互作用：如形态发生、细胞间的粘着作用、接触抑制、密度抑制等。细胞内的流动细胞内的流动：如信号传导、

15、钙离子的流动、RNA的移动、激素受体复合物的易位等。遗传学遗传学：如遗传分析、转染、转化等。27细胞培养的应用领域细胞培养的应用领域 （一）、在病毒学研究中的应用（一）、在病毒学研究中的应用 （二）、在免疫学研究中的应用（二）、在免疫学研究中的应用 （三）、在分子生物学研究中的应用（三）、在分子生物学研究中的应用 （四）、在遗传学研究中的应用（四）、在遗传学研究中的应用 （五）、在药理学研究中的应用（五）、在药理学研究中的应用 （六）、在毒理学研究中的应用（六）、在毒理学研究中的应用 （七）、在肿瘤学研究中的应用（七）、在肿瘤学研究中的应用 （八）、在器官移植中的应用（八）、在器官移植中的应用

16、28病毒病毒检验检验方法方法病毒培病毒培养养全程全程5-305-30天天细细细细胞病胞病胞病胞病变判定变判定变判定变判定荧荧荧荧光染色：光染色：光染色：光染色：1. 1. 1. 1. 病毒病毒病毒病毒涂涂涂涂片片片片2. 2. 2. 2. 血清型血清型血清型血清型专专专专一一一一 抗抗抗抗体荧体荧体荧体荧光染色光染色光染色光染色中和中和中和中和试验试验试验试验：培培培培养养养养出出出出的的的的病毒病毒病毒病毒与与与与血清型血清型血清型血清型专专专专一性抗一性抗一性抗一性抗血清作用，再接血清作用，再接血清作用，再接血清作用，再接种种种种至至至至细细细细胞胞胞胞病毒培病毒培病毒培病毒培养养养养：1

17、.1.细细胞培胞培养养2.2.接接种种至至细细胞胞29检测病毒 C P E正常细胞正常细胞病变细胞病变细胞30杂交瘤技术杂交瘤技术杂交瘤技术杂交瘤技术HybridomasHybridomas免疫学免疫学脾细胞脾细胞脾细胞脾细胞(B(B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞) )骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞长命长命长命长命不分泌抗体不分泌抗体不分泌抗体不分泌抗体分泌抗体分泌抗体分泌抗体分泌抗体短命短命短命短命分泌抗体分泌抗体分泌抗体分泌抗体长命长命长命长命KhlerKhler和和和和Milstein, 1975Milstein, 19751984年年

18、Nobel医医 学学 奖奖31培养上清中培养上清中培养上清中培养上清中X X X X抗体的检测抗体的检测抗体的检测抗体的检测克隆化培养克隆化培养克隆化培养克隆化培养单克隆杂交瘤细胞培养上清中单克隆杂交瘤细胞培养上清中单克隆杂交瘤细胞培养上清中单克隆杂交瘤细胞培养上清中X X X X抗体的检测抗体的检测抗体的检测抗体的检测杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体规模化培养规模化培养规模化培养规模化培养获得大量单克隆抗体获得大量单克隆抗体获得大量单克隆抗体获得大量单克隆抗体动物免疫动物免疫动物免疫动物免疫 细胞融合细胞

19、融合细胞融合细胞融合混合细胞的混合细胞的混合细胞的混合细胞的HATHATHATHAT筛选筛选筛选筛选) ) ) ) 分泌分泌分泌分泌X X X X抗体抗体抗体抗体B B B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞X X X X抗原抗原抗原抗原B B B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞瘤的突变株瘤的突变株瘤的突变株瘤的突变株培养数天后细胞死亡培养数天后细胞死亡培养数天后细胞死亡培养数天后细胞死亡 无限生长细胞无限生长细胞无限生长细胞无限生长细胞 分泌分泌分泌分泌X X X X抗体抗体抗体抗体只有杂交瘤细胞可长期存活下来只有杂交瘤细胞可长期存活下来只有杂交瘤

20、细胞可长期存活下来只有杂交瘤细胞可长期存活下来BALB/cBALB/c单单克克隆隆抗抗体体制制备备免疫学免疫学32在分子生物学研究中的应用在分子生物学研究中的应用1 1、 体外培养细胞的转化体外培养细胞的转化2 2、 DNADNA转导技术转导技术3 3、基因诊断和基因治疗、基因诊断和基因治疗33器官移植器官移植组织工程组织工程种子细胞（干细胞）种子细胞（干细胞）支架材料支架材料34组织工程组织工程35363738394041424344二、培养细胞的基本特征二、培养细胞的基本特征 培养细胞的生长方式和类型培养细胞的生长方式和类型 培养细胞的生长特点和生长增殖过程培养细胞的生长特点和生长增殖过程

21、 细胞培养的条件及影响因素细胞培养的条件及影响因素45（一）培养细胞的生长方式和类型（一）培养细胞的生长方式和类型粘粘附附型型细细胞胞：附附着着在在某某一一固固相相支支持持物物表表面面才才 能生长的细胞。能生长的细胞。 如如：成成纤纤维维细细胞胞、心心肌肌与与平平滑滑肌肌细细胞胞、表表皮皮细细胞胞、骨骨与与软骨细胞、肿瘤细胞软骨细胞、肿瘤细胞悬悬浮浮型型细细胞胞：不不必必附附着着于于固固相相支支持持物物表表面面，而而 在悬浮状态下即可生长的细胞。在悬浮状态下即可生长的细胞。 如：血、脾及骨髓培养的细胞及某些癌细胞如：血、脾及骨髓培养的细胞及某些癌细胞 46粘附型（贴壁型）细胞粘附型（贴壁型）细

22、胞 粘附粘附: :是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式的基本存在方式 细胞在体内、外的粘附方式存在差异细胞在体内、外的粘附方式存在差异 体内：粘附是全方位，外形具有复杂的立体特征。体内：粘附是全方位，外形具有复杂的立体特征。 体外：细胞只有一个附着平面，外形一般与体内时体外：细胞只有一个附着平面，外形一般与体内时 明显不同。明显不同。47 体外培养下，形态异常可反映其胚层起源，体外培养下，形态异常可反映其胚层起源，按照培养细胞的形态，可分为几大类型：按照培养细胞的形态，可分为几大类型： 成纤维型细胞成纤维型细胞 上皮型细胞上皮型细胞 游走型

23、细胞游走型细胞 多形型细胞多形型细胞4848成纤维型细胞成纤维型细胞上皮型细胞上皮型细胞49游走型细胞游走型细胞多形型细胞多形型细胞50成纤维型细胞成纤维型细胞来源：中胚层间充质组织起源的细胞，如：成纤维细成纤维细胞、心肌、平滑肌、成骨胞、心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮细胞细胞、血管内皮细胞。 形态：类似体内成纤维细胞的形态，胞体呈梭形或不规则三角形，胞质向外伸出23个长短不等的突起，中央有卵圆形核。生长特点：排列成放射状，漩涡状生长。51上皮型细胞上皮型细胞来源：起源于内、外胚层的细胞，如：皮肤及其衍皮肤及其衍生物、消化道、乳腺、肺生物、消化道、乳腺、肺泡、上皮性肿瘤等泡、上皮性肿瘤等。形

24、态：类似体内的上皮细胞，呈扁平、不规则、多角形，中有圆形核。生长特点：细胞紧密相连成单层膜 相靠紧密相连成薄层铺石状 52 培养细胞的形态不稳定，可因各种因素培养细胞的形态不稳定，可因各种因素而发生改变，如而发生改变，如pHpH、细胞密度、污染等因素。、细胞密度、污染等因素。 HeLaHeLa细胞：细胞： 血清血清 高血清高血清成纤维样细胞成纤维样细胞 低血清低血清上皮样细胞上皮样细胞 pHpH 标准标准pHpH上皮样细胞上皮样细胞 太酸或太碱太酸或太碱成纤维样细胞成纤维样细胞 细胞密度细胞密度 低密度低密度成纤维样细胞成纤维样细胞 高密度高密度上皮样细胞上皮样细胞 转化与否转化与否 未转化未

25、转化成纤维样细胞成纤维样细胞 转化后转化后上皮样细胞上皮样细胞535455悬浮型细胞悬浮型细胞 概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长。 来源：取自血液、脾或骨髓，尤以血中白细胞肿瘤细胞为主。 特点：在悬浮中生长良好，细胞圆形，呈单个或小细胞团。 56 优点： 生存空间大，提供数量大 传代方便(不需消化) 易于收获 可获得稳定状态 缺点： 观察不方便 很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)5758培养细胞的培养细胞的生长特点生长特点 粘附并伸展粘附并伸展 是大多数体外培养细胞的基本生长特点。是大多数体外培养细胞的基本生长特点。细胞在接种后很快便可见到细胞伸出伪足

26、附着，细胞在接种后很快便可见到细胞伸出伪足附着，与支持物形成一些接触点，接着细胞逐渐呈扁平与支持物形成一些接触点，接着细胞逐渐呈扁平或放射状伸展，逐渐形成上皮型或成纤维型或其或放射状伸展，逐渐形成上皮型或成纤维型或其他类型生长。他类型生长。 密度依赖性密度依赖性 细胞接种密度细胞接种密度过高过高或或过低过低都会都会影响影响细胞的细胞的生长、增殖。当细胞粘附生长、融合成单层时，生长、增殖。当细胞粘附生长、融合成单层时，细胞变得较为拥挤，而扁平形状的程度减少，与细胞变得较为拥挤，而扁平形状的程度减少，与培养基的接触面减少，同时，培养基中的营养物培养基的接触面减少，同时，培养基中的营养物逐渐消耗，细

27、胞分裂减弱，增殖减慢。逐渐消耗，细胞分裂减弱，增殖减慢。59二、培养细胞的生长增殖过程二、培养细胞的生长增殖过程单个细胞的细胞周期（单个细胞的细胞周期（cell cyclecell cycle）细胞系的生长过程细胞系的生长过程培养细胞传代的生存期培养细胞传代的生存期60单个细胞的细胞周期（单个细胞的细胞周期（cell cell cyclecycle）MG1SG2间期间期DNA合合成成期期前前中中后后末末有有丝丝分分裂裂期期61组织培养细胞生命期组织培养细胞生命期原代培养期原代培养期传传 代代 期期衰衰 退退 期期62原代培养期原代培养期 又称初代培养期又称初代培养期 （primary cult

28、ureprimary culture），），从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续一般持续1 14 4周。周。 此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛；细胞形态相似。但不旺盛；细胞形态相似。 细胞群是异质的，也即各细胞的遗传性状细胞群是异质的，也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。互不相同，细胞相互依存性强。63l传代培养期传代培养期l初代培养期一经传代后便改称做细胞系初代培养期一经传代后便改称做细胞系cell linecell line。l此期为三期中最长，可维持二倍体核型（二倍此期为三期中

29、最长，可维持二倍体核型（二倍体细胞系）。体细胞系）。l当传代当传代30305050代后，细胞增殖逐渐缓慢，以致代后，细胞增殖逐渐缓慢，以致完全停止。完全停止。l衰退期衰退期l细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。轮廓增强，最后衰退凋亡。64体外培养细胞一代增殖生长过程体外培养细胞一代增殖生长过程65第第3 3代代BMSCsBMSCs的分裂指数曲线的分裂指数曲线66 接触抑制接触抑制（contact inhibitioncontact inhibition）：）：贴壁生长的贴壁生长的体外正常细胞一旦汇合、相互接触后便停止了分体

30、外正常细胞一旦汇合、相互接触后便停止了分裂增殖，不再进入裂增殖，不再进入S S期，也不会出现交叉重叠生长期，也不会出现交叉重叠生长。 恶性细胞无接触抑制现象，所以可将其作为区恶性细胞无接触抑制现象，所以可将其作为区别正常细胞与癌细胞的标志之一。别正常细胞与癌细胞的标志之一。 密度抑制（密度抑制（density inhibitiondensity inhibition）：）：培养液培养液营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，发生密度抑制，导致细胞枯竭和代谢物的影响，发生密度抑制，导致细胞分裂停止。分裂停止。培养细胞生长过程中的特点

31、培养细胞生长过程中的特点67 传代细胞可连续传传代细胞可连续传7 71010代，细胞形状基本相同，代，细胞形状基本相同，但随着传代次数增多，细胞逐渐呈老化现象，表现为但随着传代次数增多，细胞逐渐呈老化现象，表现为: :细胞增殖速度明显减慢，胞浆中出现空泡及颗粒样细胞增殖速度明显减慢，胞浆中出现空泡及颗粒样物质，细胞碎片增多，细胞形态变为扁平，失去贴壁物质，细胞碎片增多，细胞形态变为扁平，失去贴壁能力，从培养瓶底脱落。能力，从培养瓶底脱落。68三、细胞培养的条件三、细胞培养的条件 水水高度纯化 糖糖葡萄糖 氨基酸氨基酸12种 维生素维生素 无机离子和微量元素无机离子和微量元素 促生长因子促生长因

32、子69各种培养基培养基天然培养基半合成培养基合成培养基血清添加蛋白半合成培养基添加蛋白合成培养基无蛋白合成培养基无血清培养基707172血血 清清 血清的种类血清的种类 血清的主要成分及主要作用血清的主要成分及主要作用 血清的使用与储存血清的使用与储存 影响血清的各种因素影响血清的各种因素 细胞培养中使用血清的缺点细胞培养中使用血清的缺点731、血清的种类、血清的种类 胎牛血清：胎牛血清：剖腹产的胎牛剖腹产的胎牛 牛血清牛血清 新生牛血清：新生牛血清：出生出生24h之内的新生牛之内的新生牛 小牛血清：小牛血清：出生出生1030d的小牛的小牛 （人血清、马血清、羊血清）（人血清、马血清、羊血清）

33、2、血清的主要成分及主要作用、血清的主要成分及主要作用 血清是由血浆去除纤维蛋白而形成，血清中含有各血清是由血浆去除纤维蛋白而形成，血清中含有各种种血浆蛋白血浆蛋白、多肽多肽、脂肪脂肪、碳水化合物碳水化合物、生长因子生长因子、激激素素、无机物无机物等，这些物质对促进细胞生长活性是达到生等，这些物质对促进细胞生长活性是达到生理平衡的。理平衡的。74A A因子：因子：能促进细胞早期生长，缩短潜伏期，能促进细胞早期生长，缩短潜伏期，清除细胞内脂肪滴。清除细胞内脂肪滴。B B因子：因子：是一种脂肪形成剂，易使细胞产生是一种脂肪形成剂，易使细胞产生脂肪滴，其本身是可溶性脂类。脂肪滴，其本身是可溶性脂类。

34、 B B因子在老年血清中含量较多，因子在老年血清中含量较多， 过滤可除去该因子。过滤可除去该因子。C C因子：因子：可使细胞发生退化。可使细胞发生退化。D D因子：因子：可促使细胞粘连，是一种粘着可促使细胞粘连，是一种粘着 因子。因子。去除去除B B、C C因子，因子，可促进可促进细胞生细胞生长长7576血清的主要作用血清的主要作用 提供基本营养物质提供基本营养物质 提供贴壁和扩展因子（提供贴壁和扩展因子（FNFN、LNLN） 提供激素及各种生长因子提供激素及各种生长因子 （FGFFGF、EGFEGF、PDGF)PDGF) 提供结合蛋白（中和代谢产物及蛋白分解酶等细提供结合蛋白（中和代谢产物及

35、蛋白分解酶等细胞障碍因素）胞障碍因素） 对培养中的细胞提供某些保护作用对培养中的细胞提供某些保护作用注意点注意点： 血清型号、种类不同，所含营养因素有差别，不可忽视； 在需要观察细胞某种特性时，血清使问题变复杂，要除去。 77血清的使用与储存血清的使用与储存 使用前的处理使用前的处理 5656灭活灭活30min 30min 去除补体成分去除补体成分 （趋势：大部分细胞培养不需灭活；（趋势：大部分细胞培养不需灭活； 需要灭活的：巨噬细胞、肥大细胞、血小板、淋巴细胞等）需要灭活的：巨噬细胞、肥大细胞、血小板、淋巴细胞等） 储存条件储存条件 灭活后分装成小包装（灭活后分装成小包装（10mL10mL、

36、20mL20mL、50mL50mL），），20 20 储存；使用前储存；使用前4 4 融化。融化。 使用浓度使用浓度 一般为一般为5 52020，最常用的是，最常用的是1010。78影响血清的各种因素影响血清的各种因素 年龄：年龄：较老动物的血清对细胞生长有抑较老动物的血清对细胞生长有抑制作用制作用 血型：血型：ABAB型血清比型血清比A A型和型和O O型血清对细胞型血清对细胞生长有利生长有利 血色素血色素 胆红质胆红质 脂肪酸脂肪酸 血清在培养液中的浓度并非越高越好血清在培养液中的浓度并非越高越好79细胞培养中使用血清的缺点细胞培养中使用血清的缺点 使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状

37、使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态。态。 如：血清可以促进成纤维细胞的生长，同时会抑制表如：血清可以促进成纤维细胞的生长，同时会抑制表皮角质细胞的生长。皮角质细胞的生长。 血清中含有一些物质对细胞会产生毒性作用。血清中含有一些物质对细胞会产生毒性作用。 如：多胺氧化酶如：多胺氧化酶每批血清之间都有差别每批血清之间都有差别，其成分不能保持一致。，其成分不能保持一致。取材过程中有可能带入取材过程中有可能带入支原体支原体、病毒病毒，对培养细，对培养细胞产生影响。胞产生影响。80影响细胞生长的因素影响细胞生长的因素 温度温度 渗透压渗透压 气体环境和气体环境和pHpH 无毒和有毒无毒和有毒 辐

38、射线和超声波辐射线和超声波 细胞接种密度细胞接种密度 容器转动速度和悬浮搅动速度容器转动速度和悬浮搅动速度81温温 度度 一般哺乳类一般哺乳类及禽类细胞体外及禽类细胞体外培养的适宜温度培养的适宜温度37373838，温度，温度过高或过低都会过高或过低都会影响到细胞的生影响到细胞的生长。长。温度对细胞生长的影响温度对细胞生长的影响82低低 温温 在低温下，细胞的代谢活力及核分裂降在低温下，细胞的代谢活力及核分裂降低。低。 温度不低于温度不低于0 0 时，虽影响细胞代谢，时，虽影响细胞代谢，但并无伤害作用；再把细胞置于但并无伤害作用；再把细胞置于252535 35 时，细胞仍能生存和生长，但速度减

39、慢。时，细胞仍能生存和生长，但速度减慢。 若温度过低，在降到冰点以下时，细胞若温度过低，在降到冰点以下时，细胞因胞外水和胞质结冰而受损死亡。因胞外水和胞质结冰而受损死亡。 若向培养液中加入若向培养液中加入甘油甘油或或二甲基亚砜二甲基亚砜等，等，封入冻存管，置于液氮中，细胞可耐受封入冻存管，置于液氮中，细胞可耐受70 70 以下温度，能以下温度，能长期储存长期储存，解冻后细胞，解冻后细胞复苏，仍能继续生长增殖，生物性状不受复苏，仍能继续生长增殖，生物性状不受影响。影响。83高高 温温 细胞在细胞在4040数小时后，再置回数小时后，再置回37 37 培养，细培养，细胞仍能继续生长；但如果在胞仍能继

40、续生长；但如果在40 40 下暴露时间太长，下暴露时间太长，对细胞生长不利，甚至变圆脱离瓶底。对细胞生长不利，甚至变圆脱离瓶底。 细胞在细胞在393940 40 培养培养1h1h，能受到一定损伤，能受到一定损伤，但仍有但仍有可能恢复可能恢复，但不能忍受温度再升高，但不能忍受温度再升高2 2 ，持续数小时，即在持续数小时，即在414142 42 中培养中培养1h1h，细胞损伤，细胞损伤严重，温度至严重，温度至43 43 以上时细胞多数以上时细胞多数被杀死被杀死。 高温主要引起高温主要引起酶的灭活酶的灭活、类脂质破坏类脂质破坏、核分核分裂的破坏裂的破坏，产生凝固酶产生凝固酶使细胞发生凝固，另外使使

41、细胞发生凝固，另外使蛋白质变性蛋白质变性。84气体环境和气体环境和pHpH 氧（氧（O O2 2）参加细胞的参加细胞的三羧酸循环三羧酸循环，产生能量，产生能量以供给细胞生长、增殖和合成各种以供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。所需成分。采用开放式培养时（碟皿或培养瓶采用开放式培养时（碟皿或培养瓶松盖培养或培养板培养），一般要松盖培养或培养板培养），一般要把细胞置于把细胞置于9595空气加空气加5 5二氧化二氧化碳碳的混合气体环境中。的混合气体环境中。85二氧化碳（二氧化碳（COCO2 2） COCO2 2既是细胞的代谢产物，又是细胞既是细胞的代谢产物，又是细胞生长所必需生长所必需的成分，的成

42、分，并与维持并与维持培养液的培养液的pHpH有关。有关。 大多数细胞适于在大多数细胞适于在pH pH 7.27.27.47.4条件下生长，低于条件下生长，低于pH pH 6.86.8或高于或高于pH 7.6pH 7.6对细胞有害，甚至造成细胞退化或死亡。对细胞有害，甚至造成细胞退化或死亡。 细胞对碱性不如对酸性的变化耐受，细胞对碱性不如对酸性的变化耐受，偏酸偏酸的条件比偏的条件比偏碱的环境对细胞生长有利。碱的环境对细胞生长有利。 随细胞数量的增多、代谢加强，释放随细胞数量的增多、代谢加强，释放COCO2 2增多，使增多，使pH pH 降低。为了维持培养基降低。为了维持培养基恒定的恒定的pHpH

43、 ，多在培养基中加入，多在培养基中加入磷磷酸盐等缓冲剂酸盐等缓冲剂。 羟乙基哌嗪乙硫磺酸（羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HepesHepes）：）：对细胞无毒性，也不对细胞无毒性，也不起缓冲作用，主要作用是起缓冲作用，主要作用是防止防止pHpH迅速变动迅速变动，在开瓶通气培，在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持较恒定的养或活细胞观察时能维持较恒定的pHpH值。值。86无污染及无毒直接或间接接触的器皿、材料污染：细菌等微生物、细胞间、有害物质87本章小结本章小结 培养细胞的生长方式和类型培养细胞的生长方式和类型 培养细胞的生长特点和生长增殖过程培养细胞的生长特点和生长增殖过程 细胞培养的条件及影响因素细胞培

44、养的条件及影响因素88细胞培养室的设细胞培养室的设置、设备和准备工作置、设备和准备工作89一、细胞培养的必备设施一、细胞培养的必备设施 无菌实验室无菌实验室 超净工作台超净工作台 恒温培养箱恒温培养箱 其他设备其他设备 （电热干燥箱、冰箱、水纯化装（电热干燥箱、冰箱、水纯化装置、普通光学显微镜、倒置显微镜、细胞置、普通光学显微镜、倒置显微镜、细胞液氮储存器、离心机、恒温水域锅、消毒液氮储存器、离心机、恒温水域锅、消毒器、抽滤装置等）器、抽滤装置等）90无菌实验室无菌实验室设计原则：设计原则：防治微生物污染和有害因素影响，防治微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘。要

45、求工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘。组成：组成： 更衣间：更衣间：放在外，供更换衣帽、鞋子等之用。放在外，供更换衣帽、鞋子等之用。 缓冲间：缓冲间：位于更衣间与操作间之间，也可同时与位于更衣间与操作间之间，也可同时与 几个操作间相通。几个操作间相通。 操作间：操作间：放在内间，供无菌操作和细胞培养，放在内间，供无菌操作和细胞培养， 房间不受日光直射，大小适宜，高房间不受日光直射，大小适宜，高2.5m2.5m。9192超净工作台超净工作台 分类分类侧流式：侧流式：气流由左侧或右侧通过台面流向对侧气流由左侧或右侧通过台面流向对侧直流式：直流式：气流从上向下或从下向上流动气流从上向下或从下向上流

46、动外流式：外流式：气流向操作者方向吹来气流向操作者方向吹来 注意事项：注意事项：使用前半小时先开紫外线灯使用前半小时先开紫外线灯灭菌，再关灭菌灯启动风机，灭菌，再关灭菌灯启动风机，然后进行操作。然后进行操作。使用后用使用后用1 1：10001000的来苏水或的来苏水或7575的酒精擦洗台面的酒精擦洗台面。 切记：不要用有机溶剂擦拭挡风玻璃。切记：不要用有机溶剂擦拭挡风玻璃。9394恒温培养箱恒温培养箱 变通电热恒温培养箱变通电热恒温培养箱 COCO2 2培养箱培养箱3737， ， ， ，饱饱和湿度，和湿度，和湿度，和湿度，5 5CO2CO29596其其 他他 设设 备备979899100101

47、二、细胞培养常用器材及处理方法二、细胞培养常用器材及处理方法 玻璃器材玻璃器材 塑料器材塑料器材 橡皮器材橡皮器材 金属器材金属器材 其他用品其他用品102玻璃器材玻璃器材 常用的玻璃器材有各种规格的玻璃瓶、培养瓶、常用的玻璃器材有各种规格的玻璃瓶、培养瓶、培养皿、吸管、离心管。培养皿、吸管、离心管。 首次使用：首次使用： 重复使用的处理步骤：重复使用的处理步骤：自来水刷洗自来水刷洗0.1稀盐酸浸泡过夜稀盐酸浸泡过夜自来水冲洗自来水冲洗自来水刷洗自来水刷洗硫酸重铬酸钾浸泡过夜硫酸重铬酸钾浸泡过夜自来水冲洗自来水冲洗10次次双蒸水冲洗双蒸水冲洗2次次单蒸水冲洗单蒸水冲洗3次次晾干、包装晾干、包装

48、121高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌20min103塑料器材塑料器材 常用的塑料器材有多孔培养板（常用的塑料器材有多孔培养板（4孔、孔、6孔、孔、12孔、孔、24孔、孔、96孔）、培养皿、培养瓶及吸头。孔）、培养皿、培养瓶及吸头。 重复使用的处理步骤：重复使用的处理步骤：自来水刷洗自来水刷洗3HCl或或2NaOH溶液浸泡过夜溶液浸泡过夜自来水充分冲洗自来水充分冲洗双蒸水冲洗双蒸水冲洗3次次紫外线直接照射或辐照灭菌紫外线直接照射或辐照灭菌104105106橡皮器材橡皮器材 首次使用：自来水刷洗自来水刷洗5 NaOH溶液煮沸溶液煮沸15min自来水冲洗自来水冲洗8次次4HCl盐酸煮沸盐酸煮沸15min自

49、来水冲洗自来水冲洗8次次双蒸水冲洗双蒸水冲洗1次次单蒸水冲洗单蒸水冲洗3次次晾干、包装晾干、包装121高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌20min107 重复使用的处理步骤：重复使用的处理步骤：注意：橡胶器材需用铝铂包装，放在铝盒内高压蒸注意：橡胶器材需用铝铂包装，放在铝盒内高压蒸汽灭菌。汽灭菌。自来水刷洗自来水刷洗洗衣粉加热煮沸洗衣粉加热煮沸10min自来水充分冲洗自来水充分冲洗单蒸水冲洗单蒸水冲洗3次次蒸馏水煮沸蒸馏水煮沸2次，每次次，每次15min晾干、包装晾干、包装121高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌20min双蒸水冲洗双蒸水冲洗1次次108其他用品其他用品 缓冲液（缓冲液（PBSPBS）：高压蒸汽消毒高压蒸汽消毒 血清：血清：5656水浴灭活水浴灭活30min30min 合成培养基：合成培养基：过滤除菌过滤除菌 （0.22m0.22m、0.45m0.45m）109小 结一、细胞培养的必备设施一、细胞培养的必备设施 无菌实验室、超净工作台、恒温培养箱无菌实验室、超净工作台、恒温培养箱、其他设备、其他设备二、细胞培养常用器材及处理方二、细胞培养常用器材及处理方法法 玻璃器材、塑料器材、橡皮器材、金属玻璃器材、塑料器材、橡皮器材、金属器材、其他用品器材、其他用品110111