《《医学细胞生物学》教学课件：第四章 细胞生物学的研究技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《医学细胞生物学》教学课件：第四章 细胞生物学的研究技术（64页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第四章 细胞生物学的研究技术 Techniques in Cell BiologyPreparatory observe put forward theoretics Design control testsCollect data Explain results Devise conclusionRefer to knowledge 第一节 细胞形态结构的观察普通光镜普通光镜普通光镜普通光镜特殊光镜特殊光镜特殊光镜特殊光镜形态观察形态观察扫描扫描扫描扫描电镜电镜电镜电镜高压电镜高压电镜高压电镜高压电镜透射电镜透射电镜透射电镜透射电镜扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜暗视
2、野显微镜暗视野显微镜暗视野显微镜暗视野显微镜相差显微镜相差显微镜相差显微镜相差显微镜微分干涉差显微镜微分干涉差显微镜微分干涉差显微镜微分干涉差显微镜荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜光学显微镜光学显微镜光学显微镜光学显微镜电子显微镜电子显微镜电子显微镜电子显微镜扫描探针显微镜扫描探针显微镜扫描探针显微镜扫描探针显微镜原子力显微镜原子力显微镜原子力显微镜原子力显微镜一、显微结构的观察一、显微结构的观察显微结构（显微结构（microscopic structure）-通过光通过光学显微镜观察到的细胞结构。学显微镜观察到的细胞结构
3、。（一）普通光学显微镜（一）普通光学显微镜（二）相差显微镜（二）相差显微镜（三）微分干涉差显微镜（三）微分干涉差显微镜（四）暗视野显微镜（四）暗视野显微镜（五）激光扫描共聚焦显微镜（五）激光扫描共聚焦显微镜（六）荧光显微镜（六）荧光显微镜普通光学显微镜普通光学显微镜目镜物镜集光器载物台光源最大分辨率最大分辨率 0.2m0.2m；最大放大倍数；最大放大倍数 10001000倍。倍。H-E染色后的上皮柱状细胞染色后的上皮柱状细胞相差显微镜相差显微镜(phase contrast microscope)倒置相差显微镜倒置相差显微镜环状光阑环状光阑相板相板荷荷兰兰物物理理学学家家 F. Zernike
4、 于于1932年年发发明明：利利用用光光的的衍衍射射和和干干涉涉特特性性，把把透透过过标标本本不不同同区区域域的的光光程程差差转转变变成成振振幅幅差差，从从而而提提高高了了活活细细胞胞结结构构的的反反差差，解解决决了了对对活细胞观察的难题，获诺贝尔物理学奖（活细胞观察的难题，获诺贝尔物理学奖（1953）。）。微分干涉差差显微镜微分干涉差差显微镜(differential interference contrast (DIC) microscope)Nomarski于于1952年在相差显微镜原理的基础上年在相差显微镜原理的基础上发明，其优点是能发明，其优点是能显示结构的三维立体投影影像显示结构的
5、三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故差别更大，故影像的立体感更强影像的立体感更强。DIC显微镜下的显微镜下的硅藻（伪彩色）硅藻（伪彩色） 聚光镜中央有挡光聚光镜中央有挡光片，照明光线不直片，照明光线不直接进人物镜，只允接进人物镜，只允许被标本反射和衍许被标本反射和衍射的光线进入物镜。射的光线进入物镜。视野的背景是黑的，视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。物体的边缘是亮的。暗视野显微镜暗视野显微镜(dark field microscope)能见到小至能见到小至 4nm的微粒子，分辨率可比普通显微的微粒子，分辨率可比普
6、通显微镜高镜高50倍。倍。 DIC显微镜显微镜暗视野显微镜暗视野显微镜相差显微镜相差显微镜普通显微镜普通显微镜荧光显微镜荧光显微镜(Fluorescence Microscope)照明方式为落射式，即光源通过物镜投射于样品；照明方式为落射式，即光源通过物镜投射于样品；光源为短波光，分辨力高于普通显微镜；光源为短波光，分辨力高于普通显微镜；有两个特殊的滤光片，有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外等，间的用于滤除紫外等，用以保护人目。用以保护人目。分裂细胞的分裂细胞的分裂细胞的分裂细胞的免疫荧光图像免疫荧光图像免疫荧光图像免疫
7、荧光图像抗原抗原抗原抗原( ( ( (细胞的蛋白质成分细胞的蛋白质成分细胞的蛋白质成分细胞的蛋白质成分) ) ) )特异性结合特异性结合特异性结合特异性结合荧光染料荧光染料抗抗抗抗 体体体体用激光作光源，在细胞不同焦距平面作断层扫描，用激光作光源，在细胞不同焦距平面作断层扫描，得到光学切片，并可整合为三维影像。得到光学切片，并可整合为三维影像。激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM)二、亚微结构的观察二、亚微结构的观察亚微结构（亚微结构（submicroscpic structure）- 细胞细胞中直径小于中直
8、径小于0.2um的结构。的结构。超微结构（超微结构（ultramicroscopic structure）- 接接近分子水平的结构。近分子水平的结构。（一）电子显微镜（一）电子显微镜（二）扫描探针显微镜（二）扫描探针显微镜用电子束作光源，用用电子束作光源，用电磁场作透镜，分辨电磁场作透镜，分辨力可达力可达0.2nm。主要用于观察细胞内主要用于观察细胞内部结构。部结构。由于电子束的穿透力由于电子束的穿透力很弱，用于电镜的标很弱，用于电镜的标本须制成厚度约本须制成厚度约40-50nm的超薄切片。的超薄切片。透射电镜透射电镜(transmission electron microscope，TEM
9、)电子束在样品表面扫描，样品产生的二次电子被电子束在样品表面扫描，样品产生的二次电子被收集、转换、放大后显示在荧光屏上。收集、转换、放大后显示在荧光屏上。扫描电镜扫描电镜(scanning electron microscope，SEM )图像为立体形象，图像为立体形象，反映了标本的表面反映了标本的表面结构。结构。分辨力约为分辨力约为3nm。 加速电压大于加速电压大于120kV的透射电镜。的透射电镜。穿透力强，观察标本的厚度可达穿透力强，观察标本的厚度可达10um，已达一，已达一个完整个完整细胞厚度。胞厚度。可以得到可以得到细胞内部的三胞内部的三维精精细结构构图象，如象，如细胞胞骨架的立体网骨
10、架的立体网络。高压电镜高压电镜(high voltage electron microscope)超薄切片技术超薄切片技术负染色技术负染色技术 （染背景不染样品）（染背景不染样品）冰冻蚀刻复型技术冰冻蚀刻复型技术 扫描电镜样品制备技术扫描电镜样品制备技术电镜样品的制样技术电镜样品的制样技术冰冻蚀刻复型技术冰冻蚀刻复型技术 标本置于标本置于-196C液氮中冰冻后用冷刀骤然将标本液氮中冰冻后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为出断面结构，称为蚀刻（蚀刻（etching）。蚀刻蚀刻蚀刻蚀刻断裂断裂断裂断裂蚀刻后，向断面以
11、蚀刻后，向断面以45度角度角喷涂一层蒸汽铂，再以喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反度角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯酸差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为铂的膜剥下来，此膜即为复膜（复膜（replica）。复膜显示出了标本蚀刻面复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。裂面处的结构。 复膜复膜复膜复膜根据量子力学原理中的隧道效应而设计。根据量子力学原理中的隧道效应而设计。 分辨率很高，横向为分辨率很高，横向为0.10.2nm，纵向可达，纵向可
12、达0.001nm。固态、液态和气态物质均可进行观察。固态、液态和气态物质均可进行观察。利用扫描隧道显微镜可直接观察生物大分子，如利用扫描隧道显微镜可直接观察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵，和某些和蛋白质等分子的原子布阵，和某些生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。 扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜(scanning tunneling microscope，STM )相对于扫描隧道显微镜，原子力显微镜不要求所相对于扫描隧道显微镜，原子力显微镜不要求所观察样品一定要有导电性，所以适用于任何生物观察样品一定要有导电性，所以适用于任何生物大
13、分子的观察。还可以在空气或各种溶剂体系中大分子的观察。还可以在空气或各种溶剂体系中直接观察，故其适用范围有明显扩大。直接观察，故其适用范围有明显扩大。不会引起样品表面分子的漂移和损坏，其图象的不会引起样品表面分子的漂移和损坏，其图象的可重复性大大提高。可重复性大大提高。原子力显微镜原子力显微镜第二节 细胞的分离与培养细胞的分离与培养有效获得单一类型的细胞有效获得单一类型的细胞获得较大的细胞群体获得较大的细胞群体细胞工程方面的应用细胞工程方面的应用一、细胞的分离一、细胞的分离利用组织块制备细胞悬液，一般用蛋白水解酶处理。利用组织块制备细胞悬液，一般用蛋白水解酶处理。从细胞悬液中分离某种细胞：从细
14、胞悬液中分离某种细胞： 流式细胞仪流式细胞仪（flow cytometer, FCM） 亦称亦称荧光激活细胞分选器荧光激活细胞分选器(fluorescence-activated cell sorting, FACS)二、细胞的体外培养二、细胞的体外培养一定条件下，大多数细胞都可以在体外存活并增殖，一定条件下，大多数细胞都可以在体外存活并增殖，而且可以表现出它在体内的一些分化特性。而且可以表现出它在体内的一些分化特性。1. 1. 1. 1. 细胞体外生长条件：细胞体外生长条件：细胞体外生长条件：细胞体外生长条件：培养基：培养基：培养基：培养基：必须氨基酸、维生素、动物血清、必须氨基酸、维生素、
15、动物血清、必须氨基酸、维生素、动物血清、必须氨基酸、维生素、动物血清、 糖、盐糖、盐糖、盐糖、盐支持物：支持物：支持物：支持物：塑料、玻璃，或包被包外基质塑料、玻璃，或包被包外基质塑料、玻璃，或包被包外基质塑料、玻璃，或包被包外基质其它条件：其它条件：其它条件：其它条件：pHpHpHpH值、值、值、值、COCOCOCO2 22 2、温度、湿度，、温度、湿度，、温度、湿度，、温度、湿度，无菌环境无菌环境无菌环境无菌环境等等等等原代培养：原代培养：由起始实验材料所进行的细胞培养由起始实验材料所进行的细胞培养传代培养：传代培养：对已有的细胞进行的继续培养对已有的细胞进行的继续培养细胞系：细胞系：通过
16、原代培养所长出的细胞培养物通过原代培养所长出的细胞培养物有限性细胞系：有限性细胞系：不能传代或只能传少数几代不能传代或只能传少数几代连续性细胞系：连续性细胞系：能够连续地传很多代能够连续地传很多代永久性细胞系：永久性细胞系：能够无限地传代能够无限地传代细胞株：细胞株：由单一类型的细胞所组成的细胞系。由单一类型的细胞所组成的细胞系。一些有关细胞培养的概念一些有关细胞培养的概念2. 2. 2. 2. 体外培养细胞的特性体外培养细胞的特性体外培养细胞的特性体外培养细胞的特性形态特征：形态特征：形态特征：形态特征：上皮形、梭形、多角形、圆形上皮形、梭形、多角形、圆形上皮形、梭形、多角形、圆形上皮形、梭
17、形、多角形、圆形增殖特性：增殖特性：增殖特性：增殖特性：一般细胞能传十代左右，一般细胞能传十代左右，一般细胞能传十代左右，一般细胞能传十代左右， 少数细胞可传少数细胞可传少数细胞可传少数细胞可传40-5040-5040-5040-50代代代代 极少数细胞变成永久细胞极少数细胞变成永久细胞极少数细胞变成永久细胞极少数细胞变成永久细胞 人为分为人为分为人为分为人为分为 I II III I II III I II III I II III 三个时期三个时期三个时期三个时期 （增殖期、平殖期、衰退期）（增殖期、平殖期、衰退期）（增殖期、平殖期、衰退期）（增殖期、平殖期、衰退期）功能特性：功能特性：功
18、能特性：功能特性：可以保留活体组织中的某些功能特性，可以保留活体组织中的某些功能特性，可以保留活体组织中的某些功能特性，可以保留活体组织中的某些功能特性，随着传代代数增多，功能特性逐渐丧失的也越多。随着传代代数增多，功能特性逐渐丧失的也越多。随着传代代数增多，功能特性逐渐丧失的也越多。随着传代代数增多，功能特性逐渐丧失的也越多。三、细胞融合三、细胞融合细胞融合（细胞融合（cell fusion）：两个或两个以上的细：两个或两个以上的细胞相互接触并合并而形成一个细胞的现象。胞相互接触并合并而形成一个细胞的现象。人工诱导的方法：人工诱导的方法：生物诱导法、化学诱导法、物生物诱导法、化学诱导法、物理
19、诱导法。理诱导法。异核体（异核体（heterokaryon）：两个不同的细胞融合：两个不同的细胞融合到一起，但其核仍然是分开的。到一起，但其核仍然是分开的。合核体（合核体（synkaryon）杂种细胞系（杂种细胞系（hybrid cell line）第三节 细胞组分的分析细胞组分的分析一、细胞器和大分子的离心分离一、细胞器和大分子的离心分离适合于各种细胞器和大分子的分离。适合于各种细胞器和大分子的分离。原理：原理：利用各种细胞器或组分的大小和相对密度的利用各种细胞器或组分的大小和相对密度的差异，在同一离心场内的沉降速度不同。差异，在同一离心场内的沉降速度不同。过程：匀浆，离心分离，分析过程：匀
20、浆，离心分离，分析马达马达冷冻冷冻冷冻冷冻真空真空真空真空沉降物沉降物沉降物沉降物转子转子转子转子 装甲室装甲室装甲室装甲室匀浆物匀浆物匀浆物匀浆物肝脏肝脏肝脏肝脏上清夜上清夜上清夜上清夜完整完整完整完整细胞细胞细胞细胞完整完整完整完整细胞细胞细胞细胞1000g1000g20min20min核核线粒体线粒体线粒体线粒体溶酶体溶酶体溶酶体溶酶体过氧化物酶体过氧化物酶体过氧化物酶体过氧化物酶体微粒体微粒体微粒体微粒体内质网内质网内质网内质网100000g100000g120min120min105000g105000g20min20minDNaseDNase静置静置静置静置20min20min10
21、000g10000g20min20min核糖体核糖体核糖体核糖体二、蛋白质的层析分离二、蛋白质的层析分离蛋白质是细胞中重要的组分，种类繁多，生化性蛋白质是细胞中重要的组分，种类繁多，生化性质和功能活动复杂。质和功能活动复杂。原理：原理：利用分子的大小、极性及亲水性等生化特利用分子的大小、极性及亲水性等生化特性将不同类型蛋白质进行分离。性将不同类型蛋白质进行分离。分离方法：柱层析（离子交换，疏水分子筛，亲分离方法：柱层析（离子交换，疏水分子筛，亲和性）；高压液相层析。和性）；高压液相层析。凝胶过滤柱层析凝胶过滤柱层析凝胶过滤柱层析凝胶过滤柱层析离子交换柱层析离子交换柱层析离子交换柱层析离子交换柱
22、层析亲合层析亲合层析亲合层析亲合层析三、蛋白质的电泳分析三、蛋白质的电泳分析电泳分析可以得到蛋白质分子大小，以及是否由电泳分析可以得到蛋白质分子大小，以及是否由多个亚基单位组成等的信息。多个亚基单位组成等的信息。原理：原理：在一个电场中，蛋白质的迁移率与其大小、在一个电场中，蛋白质的迁移率与其大小、形状和电荷的强弱等因素有关。形状和电荷的强弱等因素有关。方法：方法：SDS-PAGE, western blotting, 二维凝胶二维凝胶电泳（电泳（2-D）。）。四、四、RNA的分离与分析的分离与分析分离方法：分离方法：在抑制在抑制RNA酶前提下，利用酶前提下，利用RNA分分子通常很小且可溶于水
23、，并能在乙醇中沉淀等生子通常很小且可溶于水，并能在乙醇中沉淀等生化特征将其分离。化特征将其分离。分析的目的：分析的目的：了解某一特定细胞或组织中某个或了解某一特定细胞或组织中某个或某些基因的某些基因的 mRNA 水平。或者比较两种或多种水平。或者比较两种或多种类型或状态细胞中基因活动的差异。类型或状态细胞中基因活动的差异。分析的方法：分析的方法：PCR，Northern 杂交，杂交，mRNA的的消减杂交及基因芯片等。消减杂交及基因芯片等。五、五、DNA 的分离与分析的分离与分析基因组基因组DNA分离的方法分离的方法：使用：使用RNA酶消化掉细酶消化掉细胞内存在的各种胞内存在的各种RNA，利用，
24、利用DNA溶于水，可以溶于水，可以被乙醇沉淀的特性将其分离。被乙醇沉淀的特性将其分离。分离分离DNA的目的：的目的： 认识与细胞某一特定生命认识与细胞某一特定生命活动相关基因的结构和功能。前提是要知道所活动相关基因的结构和功能。前提是要知道所分离基因的核苷酸序列（部分或全部的）。分离基因的核苷酸序列（部分或全部的）。第四节 活细胞内分子的分析活细胞内分子的分析目的：认识一些特殊分子在细胞内存在的量和位目的：认识一些特殊分子在细胞内存在的量和位置，以及他们在细胞生命活动中的动态变化等方置，以及他们在细胞生命活动中的动态变化等方面情况。面情况。一、细胞内分子的示踪一、细胞内分子的示踪将放射性核素标
25、记的，可参与某种大分子物质合将放射性核素标记的，可参与某种大分子物质合成的前体物质加入到细胞培养液中，经过一定时成的前体物质加入到细胞培养液中，经过一定时间的培养，使标记的前体物质进入细胞内，带有间的培养，使标记的前体物质进入细胞内，带有放射性的前体物质便可进入大分子中。放射性的前体物质便可进入大分子中。追踪放射性标记即可探知相关生物大分子的情况。追踪放射性标记即可探知相关生物大分子的情况。常用常用常用常用3 3HH胸腺嘧啶脱氧核苷显示胸腺嘧啶脱氧核苷显示胸腺嘧啶脱氧核苷显示胸腺嘧啶脱氧核苷显示DNADNA的放射自显影图像的放射自显影图像的放射自显影图像的放射自显影图像二、细胞内离子浓度的测定
26、二、细胞内离子浓度的测定探测细胞内离子分子及其浓度的瞬时改变。需要探测细胞内离子分子及其浓度的瞬时改变。需要有精密的设备和专门的技术。有精密的设备和专门的技术。局部离子浓度测定局部离子浓度测定：膜片钳技术。：膜片钳技术。瞬间快速变化的离子浓度测定瞬间快速变化的离子浓度测定：利用离子敏感性：利用离子敏感性指标剂去感受某种离子的存在，并以发光的强弱指标剂去感受某种离子的存在，并以发光的强弱来反映所测定离子浓度的高低。如，发光蛋白指来反映所测定离子浓度的高低。如，发光蛋白指标剂，荧光钙指标剂。标剂，荧光钙指标剂。三、特殊分子向细胞的导入三、特殊分子向细胞的导入可阻断特定内源性分子功能活动的分子可阻断
27、特定内源性分子功能活动的分子：如：如抗体抗体或其他或其他抑制物抑制物等。等。带有标记的可参与细胞结构与功能活动的分子：带有标记的可参与细胞结构与功能活动的分子：如荧光标记的微管蛋白如荧光标记的微管蛋白 方法：方法： 显微注射显微注射 直接扩散直接扩散 膜泡介导法膜泡介导法四、细胞内特异分子的原位鉴定四、细胞内特异分子的原位鉴定主要是细胞内的蛋白质分子主要是细胞内的蛋白质分子原理原理：利用抗体对抗原的特异性识别与结合的特：利用抗体对抗原的特异性识别与结合的特性，实现对目标蛋白质在细胞内存在、分布，以性，实现对目标蛋白质在细胞内存在、分布，以及其与细胞功能活动相关性的认识。及其与细胞功能活动相关性
28、的认识。方法：免疫组织化学，免疫细胞化学方法：免疫组织化学，免疫细胞化学一、细胞的活体内移植一、细胞的活体内移植 将细胞标记上荧光或其他示踪物，再将它们移植将细胞标记上荧光或其他示踪物，再将它们移植到适当的动物体内，然后连续地在不同的时间点到适当的动物体内，然后连续地在不同的时间点取材，并以一定的方法分析所植入细胞在活体中取材，并以一定的方法分析所植入细胞在活体中的行为。的行为。第五节 细胞的活体内研究二、活体动物细胞的遗传修饰二、活体动物细胞的遗传修饰转基因小鼠（转基因小鼠（transgenic mouse）基因剔除小鼠（基因剔除小鼠（gene knockout mouse）基因替换小鼠（基因替换小鼠（gene knockin mouse）
