《蛋白质组学proteomicswxj课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质组学proteomicswxj课件（100页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Proteomics蛋白质组学蛋白质组学博学至精博学至精 明德至善明德至善Proteome&Proteomics定义定义nProteome：n1994年，由澳大利亚年，由澳大利亚Macguarie大学的大学的Wilkins等等首先提出：首先提出：“蛋白质组指蛋白质组指由一个细胞或一个组织由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部蛋白质的基因组所表达的全部蛋白质”n“proteome”是由蛋白质一词的前几个字母是由蛋白质一词的前几个字母“prote”和基因组一词的后几个字母和基因组一词的后几个字母“ome”拼拼接而成接而成博学至精博学至精 明德至善明德至善Proteome&Proteomics定义
2、定义nProteomics：n蛋白质组学是从整体水平细胞内蛋白质的蛋白质组学是从整体水平细胞内蛋白质的组成组成、结构结构、功能功能及其及其动态变化规律动态变化规律的科学。的科学。n研究内容包括分析蛋白质组所有组分及它们的表研究内容包括分析蛋白质组所有组分及它们的表达水平，确定各种组分的空间定位、修饰方法、达水平，确定各种组分的空间定位、修饰方法、互作机制、生物活性及相应特定功能等。互作机制、生物活性及相应特定功能等。n由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识谢等过程的整体而全面的认识博学至精博学至精 明德至善明德至善Geno
3、me & Proteome博学至精博学至精 明德至善明德至善Genomics Transcriptomics & Proteomics博学至精博学至精 明德至善明德至善Proteomics&StructuralGenomics博学至精博学至精 明德至善明德至善Proteomics&FunctionalGenomics博学至精博学至精 明德至善明德至善特点之一整体性博学至精博学至精 明德至善明德至善特点之二系统性博学至精博学至精 明德至善明德至善特点之三动态性博学至精博学至精 明德至善明德至善nStructuralProteomicsn结构蛋白质组学结构蛋白质组学nFunctionalProte
4、omicsn功能蛋白质组学功能蛋白质组学分类博学至精博学至精 明德至善明德至善StructuralProteomicsnSeparationnIdentificationnPTM(post-translationalmodification)IdentificationnComparison&SubtractionAnalysis博学至精博学至精 明德至善明德至善FunctionalProteomicsnLocalizationnProteinComplexDeterminationnProtein-ProteinInteraction/InteractionNetworknFunctiono
5、fProtein(MetabolicandRegulatoryPathway;SignalTransductionPathway)博学至精博学至精 明德至善明德至善n蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合生物质谱、Western印迹、蛋白质芯片等技术，对蛋白质进行全面的鉴定研究。n翻译后修饰的鉴定：如磷酸化、糖基化、酶原激活等过程。n蛋白质功能确定：包括蛋白质定位研究，蛋白质活性，蛋白质相互作用，酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析，配基-受体结合分析等。蛋白质组学的主要任务蛋白质组学研究思路与方法蛋白质组学研究思路与方法策略、技术、工具策略、技术、工具博学至精博学至精 明德至善明德至
6、善主要专业术语及其英文对照和缩写主要专业术语及其英文对照和缩写nIPG-IEF：固相固相pH梯度等电聚焦（梯度等电聚焦（immobilizedpHgradientsisoelectricfocusing）nSDS-PAGE：十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳（泳（Sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis）n2-DE：双向电泳双向电泳(TwoDimensionalElectrophoresis)nHPLC：高效液相色谱高效液相色谱（HighperformanceLiquidChromatography
7、）nMALDI-TOFMS：基质辅助激光解吸电离飞行时：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（间质谱（MatrixAssistedLaserDesorption/IonizationTime-of-FlightMassSpectrometry)博学至精博学至精 明德至善明德至善n蛋白序列数据库（SWISS-PROT/TrEMBL；http:/www.expasy.ch）n基因序列数据库（Genbank，http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/EMBL；http:/www.ebi.ac.uk/）n蛋白模式数据库（Prosite；http:/www.expasy.ch/sprot/pro
8、site.html）n蛋白质二维凝胶电泳数据库、蛋白三维结构数据库（PDB，http:/www.pdb.bnl.gov/；FSSP，http:/www.embl-ebi.ac.uk）n蛋白翻译后修饰数据库（O-GLYCBASE，http:/www.cbs.dtu.dk/databases/OGLYCBASE）蛋白质组学研究相关数据库蛋白质组学研究相关数据库博学至精博学至精 明德至善明德至善研究策略研究策略n两条互补的实验流程两条互补的实验流程n基于凝胶的工作流程基于凝胶的工作流程（Gel-basedworkflow）n基于液相色谱的工作流程基于液相色谱的工作流程（LC-basedworkflo
9、w）博学至精博学至精 明德至善明德至善Classical GE & LC to Protein ID Gapelo (2010) J ProteomicsHPLC-MS博学至精博学至精 明德至善明德至善博学至精博学至精 明德至善明德至善蛋白质组研究的主要手段蛋白质组研究的主要手段v双向电泳（twodimensionalgelelectrophoresis,2D-GE）v差示电泳（differentialgelelectrophoresis,DIGE）v毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,CE) v高效液相色谱(highperformanceliquidchromato
10、graphy,HPLC)分子筛柱层析分子筛柱层析反向柱层析反向柱层析v质谱分析(massspectrometryMS) 基质基质辅助激光解吸离子化辅助激光解吸离子化-飞行时间串联质谱飞行时间串联质谱(matrix-assistedlaserdisorptionionization-timeofflight/tandemMS,MALDI-TOF/MS/MS)电喷雾离子化电喷雾离子化串联质谱串联质谱（electrosprayionizationESI-MS）v生物信息学博学至精博学至精 明德至善明德至善蛋白质组学实验室所需的条件蛋白质组学实验室所需的条件博学至精博学至精 明德至善明德至善蛋白质组学
11、研究的基本技术路线蛋白质组学研究的基本技术路线蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备双向电泳或双向电泳或HPLC图像分析图像分析凝胶中的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的蛋白溶液中的蛋白混合肽混合肽蛋白质质量蛋白质质量N端测序端测序肽序列质谱数据肽序列质谱数据肽肽指纹图指纹图数据搜索数据搜索新的或已知蛋白新的或已知蛋白翻译后修饰的鉴定翻译后修饰的鉴定酶解酶解博学至精博学至精 明德至善明德至善SampleProteinPreparation1.Usuallythecomplexityoftheproteinand/orpeptidemixtureliesbeyondthetheoreticalseparatio
12、nspaceofanyseparationmethod.2.ProteomeComplexity.Genomictranscriptionindiversity;post-transcriptionprocessing;post-translationalmodification;constitutionofcombinatorialcomplex.3.Itrequiresquitealongtimeforanalysisofproteincomplex.a)Samplerecoverylowthroughseparation:moresteps,lessoverallrecovery.b)T
13、heconc.oftheproteinswitharangeof6-ordermagnitude:intissues,proteinconcentrationsspanadynamicrangeofsixordersofmagnitudes(forregulatoryproteinorTFsafewmoleculespercell,forhousekeepingproteinsmillioncopiespercell).So,itisdifficulttodetectverylowconcentratedproteinsinthepresenceofhighlyabundantproteins
14、.c)Thecomplexproteinsampleswithlimitedstabilityduetoexistenceofenzymesandproteases,enzymeinhibitorscanonlypartlystabilizethesample.博学至精博学至精 明德至善明德至善4.Manyparametersinfluencethecompositionofproteomebetweeninducedandinherentbiologicalvariations,suchasgeneticdifferences,genderandageofpatientsandcellgro
15、wthconditions.Thisrequiressamplereplicates.(statisticianswoulddemandatleastfivereplicates,inmanycasesthreereplicatescandeliverhighlyconfidentresults.Inclinicalthenumberofrequiredproteinsaremuchhigh).5.Membraneproteinsareverydifficulttosolubilize,andeasytolossduringsamplepreparationandseparationbysti
16、ckingtoasurfaceoraggregation.6.Post-translationalmodifications(PTMs)likephosphorylationandglycosylationrequiresophisticatedanalysistoolslikeMSn,wherethepeptideionsgeneratedseveraltimesfragmented.SampleProteinPreparation博学至精博学至精 明德至善明德至善蛋白质组研究的基本技术蛋白质组研究的基本技术-样品预分离样品预分离n样品的制备（预处理）样品的制备（预处理）：n组织组织n细胞细
17、胞n细胞器（线粒体、叶绿体、细胞核）细胞器（线粒体、叶绿体、细胞核）博学至精博学至精 明德至善明德至善蛋白质组研究的基本技术蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取蛋白提取n重要性：重要性：n在制备时丢失的蛋白永远不能在后面实验中弥补在制备时丢失的蛋白永远不能在后面实验中弥补n原则：原则：n使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态n防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀n防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）饰（如酶性或化学性降解等）n完全去除样品中的核酸和某些
18、干扰蛋白完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白博学至精博学至精 明德至善明德至善蛋白质组研究的基本技术蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取蛋白提取n步骤：步骤：n破碎破碎n沉淀蛋白沉淀蛋白n去除杂质去除杂质博学至精博学至精 明德至善明德至善蛋白质组研究的基本技术蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取蛋白提取n样品制备流程样品制备流程-破碎破碎尽可能减少蛋白水解尽可能减少蛋白水解/其它形式蛋白降解原则其它形式蛋白降解原则n机械法（超声波法、高压法机械法（超声波法、高压法、机械匀浆法、机械匀浆法）n化学法（去污剂法、酶裂解法化学法（去污剂法、酶裂解法）n物理法（液氮研磨法、反复冻融法、渗透物理法（液氮研磨法、反
19、复冻融法、渗透法法、玻璃珠破碎法、玻璃珠破碎法）博学至精博学至精 明德至善明德至善蛋白质组研究的基本技术蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取蛋白提取n样品制备流程样品制备流程-沉淀蛋白沉淀蛋白去杂浓缩后蛋白可溶性是关键去杂浓缩后蛋白可溶性是关键n三氯醋酸（三氯醋酸（TCA）-丙酮沉淀法丙酮沉淀法nTCA沉淀法沉淀法引起降解引起降解/修饰修饰n丙酮沉淀法丙酮沉淀法n硫酸铵沉淀法硫酸铵沉淀法影响影响IEFn醋酸铵沉淀法醋酸铵沉淀法步骤繁琐步骤繁琐博学至精博学至精 明德至善明德至善2D电泳结果影响因素分析电泳结果影响因素分析博学至精博学至精 明德至善明德至善蛋白质组研究的基本技术蛋白质组研究的基本技术-
20、蛋白提取蛋白提取n样品制备流程样品制备流程-去除杂质去除杂质关键是尽量不丢失蛋白和减少蛋白修饰关键是尽量不丢失蛋白和减少蛋白修饰n核酸的清除核酸的清除（DNase/RNase）n多糖的清除多糖的清除（超离心（超离心、TCA沉淀等）沉淀等）n去污剂的清除去污剂的清除（丙酮沉淀法等）（丙酮沉淀法等）n盐离子和外源带电小分子的清除（透析、盐离子和外源带电小分子的清除（透析、TCA-丙酮沉淀法）丙酮沉淀法）博学至精博学至精 明德至善明德至善2D电泳结果影响因素分析电泳结果影响因素分析可能原因：样品含高丰度可能原因：样品含高丰度Pr可能原因：可能原因：TCA残留致使残留致使Pr丢失丢失博学至精博学至精
21、明德至善明德至善蛋白质组研究的基本技术蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取蛋白提取n样品制备注意事项：样品制备注意事项：n蛋白质水解蛋白质水解-蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂(PMSF等等)n特殊样品的制备特殊样品的制备(低丰度低丰度、强碱性蛋白质、强碱性蛋白质（核糖体）、极端分子量（核糖体）、极端分子量)n样品定量样品定量n重复性重复性博学至精博学至精 明德至善明德至善nTwoDimensionalGelElectrophoresis(2D-GE)nDifferentialGelElectrophoresis(DIGE)GelElectrophoresis博学至精博学至精 明德至善明德至善Workfl
22、ow for Two-Dimensional Electrophoresis (2-DE)GE (2004) 2-D Electrophoresis 博学至精博学至精 明德至善明德至善twodimensionalgelelectrophoresis(2D-GE)博学至精博学至精 明德至善明德至善IsoelectricFocusingElectrophoresis(IEF)IEFmainlyappliedforthefollowingpurposes:n1stdimensionalfractionationofproteinmixturesinhigh-resolution2-Delectrop
23、horesisnPre-fractionationofproteinmixturesaccordingtochargenFortheseparationofveryheterogeneousmixturesoftrypticpeptidesinsteadofstrongcationexchangechromatographyinMDLC-MSIPG immobilized pH gradientIPG Strip for IEFpH10.0 Cathode (-)pH 3.0Anode (+)pH103博学至精博学至精 明德至善明德至善1.IEFisperformedinapHgradient
24、gel.2.ProteinsChargedwithAnion(-)orCation(+)dependon(i)theirmoleculartraitsduetotheiracidicandbasicgroups,and(ii)theenvironmentalpH.3.EnvironmentalpH:inbasicbuffer,theacidicgroupsofproteinswithnegativecharge;inacidicbuffer,thebasicgroupswithpositivecharge.4.ProteinIsoelectricPoint(pI):AtapHvalue,the
25、netchargeofaproteiniszero.39IEFTheoreticalBackground 博学至精博学至精 明德至善明德至善40The Principle of Isoelectric Focusing Electrophoresis博学至精博学至精 明德至善明德至善IEFPrinciple1.AmpholytestoCreateApHGradient:AHeterogeneousMixtureofIsomersofaliphaticoligoamino-oligocarboxylicacidsunderelectricityfieldcouldalignthemselvesd
26、uetoindividualmoleculetrait&createapHgradientalongcathodewithhigh-pHtoanodewithlow-pH.2.AmpholyteProperties:(i)highbufferingandsolubilityinitspI(ii)goodandregularelectricconductivityatitspI(iii)absenceofbiologicaleffect(iv)lowmolecularweight3.TheAmpholyte-Gel:theampholyte2%(w/v),thegel4%(T)&3%(C)4.I
27、mmobilepHGradientStripforProteinsSeparation(IPG):(i)proteinsappliedtoapositionontheIPGstripcouldbechargedwithanion,cationandzero(ii)protein-cationmovesforwardcathodeandstopthesitewherethepHvalueisequaltothepIofprotein-cation;similarityforprotein-aniontomoveforwardanodeandstop;protein-zerotobenaiveto
28、move.41博学至精博学至精 明德至善明德至善42Immobilized pH Gradient PolyacrylamideThe General Structure of Immobiline (Ampholyte)博学至精博学至精 明德至善明德至善博学至精博学至精 明德至善明德至善双向凝胶电泳（双向凝胶电泳（2-DE）n是是等电聚焦电泳等电聚焦电泳和和SDS-PAGE的组合的组合n即先进行等电聚焦电泳（按照即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离）分离）n然后再进行然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小）（按照分子大小）n凝胶经染色得到二维分布的蛋白质图凝胶经染色得到二维分布的蛋白质图博学
29、至精博学至精 明德至善明德至善蛋白质组研究的基本技术蛋白质组研究的基本技术n2D-SDS-PAGE：n样品制备样品制备n第一向第一向IPG-IEF电泳电泳nIPG平衡平衡n第二向第二向SDS-PAGE电泳电泳n染色（银染）及染色（银染）及图谱分析图谱分析n目标蛋白获取及其鉴定（目标蛋白获取及其鉴定（MC分析）分析）博学至精博学至精 明德至善明德至善博学至精博学至精 明德至善明德至善2-DEn第一向第一向IPG-IEF电泳nIEF是一种根据样品的是一种根据样品的等电点不同等电点不同而使它而使它们在们在pH梯度中相互分离的一种电泳技术梯度中相互分离的一种电泳技术n将等电点不同的蛋白质混合物加入有将
30、等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的的pH位置上，形成分离的蛋白质区带位置上，形成分离的蛋白质区带n从而得知其等电点信息从而得知其等电点信息博学至精博学至精 明德至善明德至善IPG-IEF电泳电泳博学至精博学至精 明德至善明德至善2-DEn第二向垂直第二向垂直SDS-PAGE电泳电泳n聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有浓缩聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应效应、电荷效应、分子筛效应。SDS与蛋与蛋白质形成雪茄状带负电荷复合
31、物，从而消白质形成雪茄状带负电荷复合物，从而消除了蛋白间的电荷及形状差异，除了蛋白间的电荷及形状差异，电泳速度电泳速度仅与分子量有关仅与分子量有关n从而得知其分子量信息从而得知其分子量信息博学至精博学至精 明德至善明德至善第二向垂直第二向垂直SDS-PAGE电泳电泳n凝胶浓度与其对应的分离范围凝胶浓度与其对应的分离范围胶浓度胶浓度 分离范围分离范围(KD) 5% 36-200 7.5% 24-200 10% 14-200 12.5% 14-100 15% 14-60博学至精博学至精 明德至善明德至善第二向垂直第二向垂直SDS-PAGE电泳电泳Ettan Dalt twelve电泳系统电泳系统博
32、学至精博学至精 明德至善明德至善第二向垂直第二向垂直SDS-PAGE电泳电泳Ettan Dalt six电泳系统电泳系统博学至精博学至精 明德至善明德至善2-DE凝胶蛋白质斑点的检测凝胶蛋白质斑点的检测n染色：染色：1）考马斯亮兰染色法；）考马斯亮兰染色法；2）银染法；）银染法；3）负染法；）负染法；4）荧光染色法；）荧光染色法；5）放射性同位素标记法等）放射性同位素标记法等博学至精博学至精 明德至善明德至善n安全（安全（safety）n灵敏（灵敏（sensitivity）n简单（简单（simplicity）n特异性（特异性（specificity）n快速（快速（speed）n稳定（稳定（st
33、ability）n兼容性（兼容性（synergy）理想显色剂的7S博学至精博学至精 明德至善明德至善有机染料和银染n考马斯亮蓝考马斯亮蓝染色灵敏度为染色灵敏度为30100ng30100ng，线性范围是线性范围是2020倍；倍；硝酸银染色硝酸银染色的线性范围是的线性范围是4040倍，灵敏度是考染的倍，灵敏度是考染的100100倍。倍。n胶体考马斯亮蓝胶体考马斯亮蓝染色技术可实现染色技术可实现PAGEPAGE的无背景染色，其的无背景染色，其极限灵敏度为极限灵敏度为810ng810ng，但这种染液会对蛋白质进行修饰但这种染液会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果。而影响质谱分析的结果。n氨基黑氨基黑
34、常用于转印至聚偏二氟乙烯（常用于转印至聚偏二氟乙烯（PVDFPVDF）和和/ /或硝酸或硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色。纤维素膜上的蛋白质的染色。n银染的缺点是：对某些种类的蛋白质染色效果差，对其银染的缺点是：对某些种类的蛋白质染色效果差，对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响。后的蛋白质测序和质谱分析造成影响。n这两类染色技术都可减少胶内蛋白质产量这两类染色技术都可减少胶内蛋白质产量。博学至精博学至精 明德至善明德至善CoomassieCoomassie Brilliant Blue &Silver Stain博学至精博学至精 明德至善明德至善负 染n能能专专门门提提高高PAGE胶胶上上蛋蛋白白
35、质质的的回回收收率率，但但不不能能用用于膜上染色。于膜上染色。n结果表现为结果表现为胶面着色而蛋白质点透明胶面着色而蛋白质点透明。n速速度度快快（515min），蛋蛋白白质质的的生生物物活活性性能能保保持持：一一旦旦用用络络合合剂剂如如EDTA或或Tris/甘甘氨氨酸酸转转移移缓缓冲冲液液来来络合金属离子就可进行提取来转移蛋白质。络合金属离子就可进行提取来转移蛋白质。n它它主主要要适适用用于于蛋蛋白白质质显显色色、完完整整蛋蛋白白质质的的胶胶上上被被动提取以及质谱分析。动提取以及质谱分析。n该该技技术术主主要要包包括括金金属属盐盐染染料料、锌锌咪咪唑唑染染料料等等的的使用。使用。博学至精博学至
36、精 明德至善明德至善胶体扩散染料n主要用于主要用于高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和和PVDF膜上的蛋白质膜上的蛋白质，不用于胶内染色。，不用于胶内染色。n最好的胶体金染色的灵敏度与最好的胶体金染色的灵敏度与PAGE胶内的胶内的银染类似。银染类似。n这种技术主要包括这种技术主要包括丽春红、印度墨水染料、丽春红、印度墨水染料、胶体金染料胶体金染料等。等。博学至精博学至精 明德至善明德至善有机荧光团染料n包包括括共共价价结结合合和和非非共共价价结结合合的的荧荧光光团团染染料料两两类类。后后者者最最为为常常用用，其其典典型型代代表表是是已已经经商商品品化化的的SYPROR
37、ed、Orange、Ruby等荧光染料。等荧光染料。n这这三三种种染染料料可可对对SDS-PAGE胶胶内内蛋蛋白白质质进进行行一一步步染染色色，约约3060min完完成成，灵灵敏敏度度为为210ng。染染色色后后的的凝凝胶胶用用标标准准的的实实验验室室300nm紫紫外外透透射射仪仪进进行行照照像像保保存存，其其线线性性范范围围为为3个个数量级。数量级。n这这三三种种染染料料的的电电泳泳染染色色结结果果与与在在酵酵母母中中通通过过SAGE所所获获得得的的基因表达水平的动态范围相匹配。基因表达水平的动态范围相匹配。n在在Tris/甘甘氨氨酸酸转转印印缓缓冲冲液液中中染染色色后后，蛋蛋白白质质可可被
38、被转转印印至至膜膜上并进行免疫染色或上并进行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质。测序来鉴定蛋白质。博学至精博学至精 明德至善明德至善荧光染色博学至精博学至精 明德至善明德至善金属螯合染料n这这是是一一类类与与现现代代蛋蛋白白质质组组学学研研究究相相兼兼容容的的、相相对对较较新新的的蛋蛋白白质质显显色色试试剂剂，其其设设计计专专门门与与常常用用微微量量化化学学表表征征过过程程兼兼容容。它它们们不不包包含含戊戊二二醛醛、甲甲醛醛或或Tween-20等等，很很容容易易和和集集成成化化蛋蛋白白质质组组学学平平台台（包包括括自自动动化化凝凝胶胶染染色色仪仪、图图像像分分析析工工作作站站、机机器器人人剪
39、剪切切仪仪器器、蛋蛋白白质质酶解工作站和质谱仪等）相结合。酶解工作站和质谱仪等）相结合。n其其中中SYPRORuby也也是是一一种种基基于于钌钌的的金金属属发发光染料。光染料。博学至精博学至精 明德至善明德至善同位素标记，放射自显影 灵敏度 20pg博学至精博学至精 明德至善明德至善2DE重复性重复性The same protocol and sample, however not the same resultsRec: similar; cir: different 博学至精博学至精 明德至善明德至善DIGE&ProteinsLabeledwithCyDyes1.Proteinslabel
40、edwithCyDyes:withdyescyanine(Cy2blue,Cy3red,Cy5green),thedyescannotinfluenceproteinpropertyaswellasitsmolecularweightmuch.2.TheMixedRunon2-DE:themixedratioat1:1,runonthesame2-DE,thesamekindofproteinswithdifferentdyesfromdifferentsamplescanco-migrate.3.TheMixedGelScanned:withlaserscannertoscanthemixe
41、drangelatdifferentwavelengthsaccordingtoCyDye4.TheResultReadout:thepositionandthecoloroftheproteinspotsonDIGEimage,thepositiontorepresenttheproteinID,thecolor,accordingtostandardcolorcalibratortoinfereachdyetheproportiontothedyemix,torepresenttherelativeamountofthesamekindofproteinamongdifferentsamp
42、les.64博学至精博学至精 明德至善明德至善650C x 30 minGE (2004) 2-D ElectrophoresisLysine Labeling (minimal labeling)1.In practice 400 pmol of dye is added to 50ug of protein.2.In this way only 3-5% of the proteins will receive a tag (95-97% remain unlabeled)3.Labeling reaction: no IPG buffer, no reductant, pH 8.5, 3
43、7, 30 min with dye, the epsilon-amino side group of lysine is labeled with dye. 博学至精博学至精 明德至善明德至善66Cysteine Labeling (saturation labeling)1.The high sensitivity, down to 1000 human cells (around 2.5 ug protein) could provide good 2-DE 2.Labeling reaction : no IPG buffer; TCEP reductant pH 8.0, 37 ,1
44、h; dye added pH 8.0, 37 30 min; the thio group of cysteine labeled with dyes (Cy3 or Cy5).博学至精博学至精 明德至善明德至善67Workflowfor2-DEofProteinsLabeledwithCyDyes博学至精博学至精 明德至善明德至善68Workflow for DIGE of Proteins Labeled with CyDyesGE (2004) 2-D Electrophoresis博学至精博学至精 明德至善明德至善69Proteins Labeled with CyDyesMix L
45、abeled Proteins 2-DELaser Scanner with Different WavelengthsIndividual & Overlap Image Analysis (Protein Spot Location & Color)Identification of Protein ID & Abundance1st IEF (pI)2nd SDS-PAGE (Mw)博学至精博学至精 明德至善明德至善ExampleforDIGEImagesScannedwithDifferenceWavelengthProteomicsinPracticep6970博学至精博学至精 明德
46、至善明德至善2-DE凝胶蛋白质斑点的检测凝胶蛋白质斑点的检测n图像扫描和分析图像扫描和分析ImageScannerII博学至精博学至精 明德至善明德至善2-DE凝胶蛋白质斑点的检测凝胶蛋白质斑点的检测n全自动斑点切取系统（全自动斑点切取系统（EttanSpotPicker）博学至精博学至精 明德至善明德至善质谱分析 ( MS)v质谱原理：质谱原理：样本分子离子化后,根据不同离子间质荷比(m/e )差异,分离样本,确定分子量2-DE凝胶蛋白质斑点的检测凝胶蛋白质斑点的检测博学至精博学至精 明德至善明德至善PrincipleforMassSpectrometry74Schematic of Qua
47、drupole TOF Hybrid AnalyzerWestermeier (2008) Proteomics in Practice博学至精博学至精 明德至善明德至善电喷雾质谱电喷雾质谱博学至精博学至精 明德至善明德至善n样品溶于固定的底样品溶于固定的底物中形成晶体，用物中形成晶体，用激光脉冲使其离子激光脉冲使其离子化化，离子被加速后，离子被加速后通过飞行管时分离，通过飞行管时分离，所有离子均可被检所有离子均可被检测，常用来测测，常用来测蛋白蛋白质质、多肽、核酸和多肽、核酸和多糖等生物大分子多糖等生物大分子MALDI-TOFMS博学至精博学至精 明德至善明德至善n通过质谱分析，可以获得分析
48、样品的通过质谱分析，可以获得分析样品的分子量、分子分子量、分子式、分子中同位素构成和分子结构式、分子中同位素构成和分子结构等多方面的信息等多方面的信息SARS病毒病毒N蛋白整体分子量蛋白整体分子量 博学至精博学至精 明德至善明德至善n蛋白质经过酶解成肽段后，获得所有肽段的蛋白质经过酶解成肽段后，获得所有肽段的分子质量，形成一个特异的肽质量指纹图谱分子质量，形成一个特异的肽质量指纹图谱（peptidemassfingerprinting，PMF），通），通过数据库搜索与比对，便可确定待分析蛋白过数据库搜索与比对，便可确定待分析蛋白质分子的性质质分子的性质。PeptideMassFingerpri
49、nting(PMF)博学至精博学至精 明德至善明德至善PeptideMassFingerprinting(PMF)博学至精博学至精 明德至善明德至善PeptideMassFingerprinting(PMF)博学至精博学至精 明德至善明德至善n用用PMF方法未能鉴定的蛋白质可通过质方法未能鉴定的蛋白质可通过质谱技术获得该蛋白质一段或数段多肽的串谱技术获得该蛋白质一段或数段多肽的串连质谱信息（氨基酸序列）并通过数据库连质谱信息（氨基酸序列）并通过数据库检索来鉴定该蛋白质。检索来鉴定该蛋白质。n混合蛋白质酶解后的多肽混合物直接通混合蛋白质酶解后的多肽混合物直接通过（多维）液相色谱分离，然后进入质谱
50、过（多维）液相色谱分离，然后进入质谱进行分析。进行分析。用串联质谱（MS/MS）鉴定蛋白质博学至精博学至精 明德至善明德至善用串联质谱（MS/MS）鉴定蛋白质博学至精博学至精 明德至善明德至善多肽氨基酸序列分析多肽氨基酸序列分析串联质谱（串联质谱（Tandem-MS）,第一级质谱得到肽的分子离子第一级质谱得到肽的分子离子,选取目标肽的选取目标肽的离子作为母离子，与惰性气体碰撞，使肽链中的肽键断裂，形成一系列离离子作为母离子，与惰性气体碰撞，使肽链中的肽键断裂，形成一系列离子，即子，即N端碎片离子系列（端碎片离子系列（B系列）和系列）和C端碎片离子系列（端碎片离子系列（Y系列），将这系列），将这
51、些碎片离子系列综合分析，可得出肽段的氨基酸序列。些碎片离子系列综合分析，可得出肽段的氨基酸序列。“protein ladder sequencing”的方法，通过对的方法，通过对Edman降解法的修改，产降解法的修改，产生一系列截去生一系列截去N端残基的肽段，用端残基的肽段，用MALDI-MS测得这些肽段的质量，从而测得这些肽段的质量，从而推测推测N端序列。端序列。 博学至精博学至精 明德至善明德至善841.The protonated total peptide mass is 1410.6.2.The peptide to be ionized into N-terminal ions (
52、b-ions) and C-terminal ions (y-ions).3.The alignment of these ions of the peptide from small to large according to their m/z, a unique mass spectrum for the peptide.4.The signal intensity (the height) of each ion represents the abundance of the fragment ion in system.5.Contrast of b-ions to y-ions c
53、ould infer the peptide sequence.多肽氨基酸序列分析多肽氨基酸序列分析博学至精博学至精 明德至善明德至善多肽氨基酸序列分析多肽氨基酸序列分析博学至精博学至精 明德至善明德至善IsotopeLabelingProteinSamplesviaMetabolismCampbell(2002)Discoveringp189861.Different Isotopes to label different samples via metabolism.2.Combine the samples at a ratio of one to one from diff sourc
54、es and to subject to separation, and digestion.3.Analysis by MS to produce characteristic mass spectrum (1) at every m/z point, two peaks always occurred in couple, representing the same molecule with diff mass isotopes : the front with light isotope and the following with heavy one.(2) at every m/z
55、 point, the ratio of two peaks to represent the same molecule relative abundance from diff sources.博学至精博学至精 明德至善明德至善IsotopeTagICATforLabelingofProteinSamplesinvitro871.ICAT consists of three parts (i) biotin affinity tag, bind reversibly to avidin (ii) a linker, contain 8 stable isotopes (iii) thiol
56、 group, bind to cysteine of protein 2.In ICAT molecule, if X groups present with H (=1), the ICAT is the light isotope tag.3.If X groups present with D (deuterium=2), the ICAT is the heavy isotope tag.4.The mass difference between H and D in ICAT could be discriminated by MS.博学至精博学至精 明德至善明德至善88Workf
57、low of Protein Tagged with ICAT for LC-MS Campbell (2002) Discovering 博学至精博学至精 明德至善明德至善ProteinsLabeledwithICATinvitro,AnalyzedbyMSCampbell(2002)Discoveringp191891.In vitro proteins from diff sources to be labeled with different ICAT, light and heavy mass.2.Combine the samples (the light with the hea
58、vy) and digest it.3.With affinity purification against ICAT to isolate protein fragments labeled with ICAT.4.The ICAT-label fragments to be analyzed by MS, similar to that of labeled with N14 and N15. 5.At a m/z point , there are two mass peaks, the same molecule, from different sources, labeled wit
59、h the light and the heavy ICAT.6.The peak ratio represents the same molecule with relative abundance according to diff sources. 博学至精博学至精 明德至善明德至善90Quantification and Identification Proteins by ICATCampbell (2002) Discovering 蛋白质功能研究技术蛋白质功能研究技术功能蛋白质组学功能蛋白质组学博学至精博学至精 明德至善明德至善TechniquesforStudyofProtei
60、n-ProteinInteractions1.ProteinMicroarray2.Pulldown3.Immunoprecipitation（Co-IP）&WesternBlotting4.Y2HSystem(yeasttwo-hybridsystem)5.FluorescenceResonanceEnergyTransferthroughtheproteincomplex(FRET)博学至精博学至精 明德至善明德至善Pulldown博学至精博学至精 明德至善明德至善Co-IP博学至精博学至精 明德至善明德至善Yeasttwo-hybridsystem蛋白质组在医学研究中蛋白质组在医学研究中
61、的现状和前景的现状和前景博学至精博学至精 明德至善明德至善蛋白质组在医学研究中的现状和前景蛋白质组在医学研究中的现状和前景n人类疾病的蛋白质组研究人类疾病的蛋白质组研究n直肠癌：直肠癌：Sanchez等对等对15例结肠癌和例结肠癌和13例正常例正常人的结肠上皮进行人的结肠上皮进行2-DE。建立了包括。建立了包括882和和861个斑点的结肠癌及正常人结肠粘膜个斑点的结肠癌及正常人结肠粘膜的标准胶图。结果发现在分子量为的标准胶图。结果发现在分子量为13kD和和pI值为值为5.6处的蛋白质仅出现在结肠癌处的蛋白质仅出现在结肠癌的组织中。经鉴定为：的组织中。经鉴定为：钙粒蛋白钙粒蛋白B（calgran
62、ulinB）及钙卫蛋白（）及钙卫蛋白（calprotectin）博学至精博学至精 明德至善明德至善蛋白质组在医学研究中的现状和前景蛋白质组在医学研究中的现状和前景n致病微生物的蛋白质组研究致病微生物的蛋白质组研究n检测博氏疏螺旋体与免疫有关的蛋白质检测博氏疏螺旋体与免疫有关的蛋白质n弓形体抗原的检测弓形体抗原的检测n白色念珠菌白色念珠菌-对真菌细胞壁蛋白分析筛对真菌细胞壁蛋白分析筛选抗药真菌药物选抗药真菌药物蛋白质组学研究趋势蛋白质组学研究趋势博学至精博学至精 明德至善明德至善蛋白质组学研究趋势蛋白质组学研究趋势n在应用研究方面在应用研究方面n蛋白质组学将成为寻找蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药疾病分子标记和药物靶标物靶标最有效的方法之一最有效的方法之一n在技术发展方面在技术发展方面n研究方法将更强调各种方法间的研究方法将更强调各种方法间的整合和互整合和互补补，以适应不同蛋白质的不同特征，以适应不同蛋白质的不同特征n蛋白质组学与其它学科的交叉互动蛋白质组学与其它学科的交叉互动
