第八章培养基灭菌模板课件

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1、LOGO第八章第八章 培养基灭菌培养基灭菌 在在深深层层、通通风风的的发发酵酵罐罐中中进进行行绝绝对对无无杂杂菌菌的的纯纯培培养养发发酵酵，是是生生化化工工程程所所特特有有的的问问题题。从从防防止止污污染染的的工工艺艺观观点点看看，生生化化工工程程工工作作者者所所作作出出的的最最重重要要的的贡贡献献可可能能就就是是在在发发酵酵罐罐及及与与之之有有关关的的管管道道网的设计与操作中推行和发展了无菌技术。网的设计与操作中推行和发展了无菌技术。 本本章章首首先先概概述述培培养养基基灭灭菌菌的的意意义义与与方方法法，然然后后对对培培养养基基湿湿热热灭菌的原理及工程计算加以阐述。灭菌的原理及工程计算加以阐

2、述。 重重点点：掌掌握握培培养养基基蒸蒸汽汽加加热热灭灭菌菌的的原原理理与与计计算算，了了解解空空气气过过滤除菌的机制和过滤器的设计计算。滤除菌的机制和过滤器的设计计算。第一节第一节 概概 述述v微生物是无孔不入、无处不在的，但在自然界却很难找到微生物是无孔不入、无处不在的，但在自然界却很难找到纯培养状态下生长的微生物。自从发酵工业利用纯培养技纯培养状态下生长的微生物。自从发酵工业利用纯培养技术以来，许多发酵过程特别是抗生素、氨基酸等新型发酵术以来，许多发酵过程特别是抗生素、氨基酸等新型发酵工业都要求纯种培养，即在培养期间除大量繁殖生产菌外，工业都要求纯种培养，即在培养期间除大量繁殖生产菌外，

3、不允许其它任何微生物不允许其它任何微生物(统称为杂菌统称为杂菌)存在。存在。v在培养过程中在培养过程中(特别是种子扩大培养阶段和发酵前期特别是种子扩大培养阶段和发酵前期)如有如有少数杂菌存在，它们便可在极短时间内迅速繁殖与生产菌少数杂菌存在，它们便可在极短时间内迅速繁殖与生产菌争夺养分，从而干扰生产菌正常发酵，甚至造成倒罐。争夺养分，从而干扰生产菌正常发酵，甚至造成倒罐。v为了保证发酵过程不感染杂菌，除要求设备密封及严格无为了保证发酵过程不感染杂菌，除要求设备密封及严格无菌操作外，灭菌和消毒就成为生产或实验成败的关键问题。菌操作外，灭菌和消毒就成为生产或实验成败的关键问题。在工作中所用的仪器、

4、培养基、发酵罐、管路、空气等必在工作中所用的仪器、培养基、发酵罐、管路、空气等必须进行严格的灭菌，还要对生产环境进行消毒，以保证生须进行严格的灭菌，还要对生产环境进行消毒，以保证生产菌旺盛生长，防止杂菌和噬菌体的污染。产菌旺盛生长，防止杂菌和噬菌体的污染。 v所所谓谓灭灭菌菌(Sterilization)指指的的是是用用物物理理或或化化学学因因子子除除去去物物品品上上所所有有生生活活微微生生物物的的方方法法，而而只只消消除除病病原原微微生生物物的的措措施施则则是是消消毒毒，一一般般都都笼笼统统地地称称为为杀杀菌菌或或灭灭菌菌。培培养养基基及及设设备备灭灭菌菌的的方方法法有有许许多多种种，如如加

5、加热热灭灭菌菌、射射线线灭灭菌菌和和化化学学药药剂灭菌等。剂灭菌等。1、加热灭菌、加热灭菌v微微生生物物细细胞胞由由蛋蛋白白质质组组成成，加加热热可可导导致致蛋蛋白白质质变变性性，从从而而达达到到消消灭灭微微生生物物的的目目的的。微微生生物物对对高高温温的的敏敏感感性性大大于于对对低低温的敏感性，所以采用高温灭菌是一种有效的灭菌方法。温的敏感性，所以采用高温灭菌是一种有效的灭菌方法。v(1)火焰灭菌：利用火焰直接将微生物烧死，是一种比较火焰灭菌：利用火焰直接将微生物烧死，是一种比较彻底、迅速而简单的加热灭菌法。但它只限于接种针、玻彻底、迅速而简单的加热灭菌法。但它只限于接种针、玻璃棒、试管口、

6、三角瓶口及接种管口等的灭菌，只是在接璃棒、试管口、三角瓶口及接种管口等的灭菌，只是在接种时使用。种时使用。v(2)干干热热灭灭菌菌：利利用用电电热热或或红红外外线线在在一一定定设设备备内内加加热热到到一一定定温温度度把把微微生生物物杀杀死死，一一般般用用于于不不宜宜直直接接用用火火焰焰灭灭菌菌、要要求求杀杀菌菌后后保保持持干干燥燥状状态态的的物物料料的的灭灭菌菌。干干热热灭灭菌菌必必须须采采用用高高温温，常常在在160170维持维持12h。v(3)湿湿热热灭灭菌菌：按按被被灭灭菌菌物物品品的的性性质质不不同同，选选择择各各种种不不同同温温度度的的蒸蒸汽汽进进行行灭灭菌菌。由由于于细细胞胞原原生

7、生质质在在含含水水量量高高的的情情况况下下易易变变性性凝凝固固，而而且且蒸蒸汽汽的的穿穿透透力力强强，所所以以在在同同样样温温度度下下，湿湿热热灭灭菌菌比比干干热热灭灭菌菌效效果果要要好好，加加之之蒸蒸汽汽来来源源容容易易，因因而而此此法法在在工工业生产上广泛使用。业生产上广泛使用。 2、射线灭菌、射线灭菌v通通常常使使用用紫紫外外线线、高高速速电电子子流流的的阴阴极极射射线线、X射射线线和和射射线线等等，以以紫紫外外线线最最常常用用。紫紫外外线线的的特特点点是是对对芽芽孢孢和和营营养养细细胞胞都都能能起起作作用用，但但细细菌菌芽芽孢孢和和霉霉菌菌孢孢子子对对其其抵抵抗抗力力较较大大，且且紫紫

8、外外线线穿穿透透力力极极低低，所所以以只只能能用用于于表表面面灭灭菌菌，对对固固体体物物质质灭灭菌菌不不彻彻底底。一一般般无无菌菌室室、无无菌菌箱箱和和摇摇瓶瓶间间等等可可采采用用30W紫紫外外线线灯灯照照射射2030min，以以波波长长260nm左右灭菌效力最好。左右灭菌效力最好。3、化学药剂灭菌、化学药剂灭菌 消毒剂或防腐剂的种类很多，常用的有以下几种：消毒剂或防腐剂的种类很多，常用的有以下几种：v(1)0.10.25%KMnO4溶液：用于皮肤、水果、饮具的消毒。溶液：用于皮肤、水果、饮具的消毒。v(2)0.51%漂白粉溶液：用于用具和车间环境灭菌。漂白粉溶液：用于用具和车间环境灭菌。v(

9、3)75%酒精溶液：用于皮肤和玻璃器皿表面灭菌。酒精溶液：用于皮肤和玻璃器皿表面灭菌。v(4)0.25%新新洁洁尔尔溶溶液液：用用于于皮皮肤肤和和小小器器皿皿表表面面消消毒毒及及环环境境消消毒毒。 v(5)10%甲甲醛醛溶溶液液：用用于于无无菌菌室室、摇摇瓶瓶间间、空空罐罐和和车车间间的的熏熏蒸蒸消消毒，一般每毒，一般每m3空间使用空间使用3740%甲醛甲醛10mL。v(6)苯苯酚酚溶溶液液：25%的的苯苯酚酚(石石碳碳酸酸)溶溶液液用用于于器器械械及及车车间间环环境境的喷雾消毒，的喷雾消毒，0.5%的溶液为防腐剂。的溶液为防腐剂。v(7)来苏尔：是甲醛与肥皂的混合液，常用来苏尔：是甲醛与肥皂

10、的混合液，常用25%的溶液来消毒的溶液来消毒皮肤、桌面及用具等，对皮肤刺激性比石碳酸小。皮肤、桌面及用具等，对皮肤刺激性比石碳酸小。 1.1.化学试剂灭菌法化学试剂灭菌法 甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等 适用范围：环境、皮肤及器械的表面消毒适用范围：环境、皮肤及器械的表面消毒2.2.射线灭菌射线灭菌法法3.3.干热灭菌法干热灭菌法 电磁波、紫外线或放射性物质电磁波、紫外线或放射性物质适用范围：无菌室、接种箱适用范围：无菌室、接种箱常用烘箱，灭菌条件：常用烘箱，灭菌条件：160160下保温下保温1h 1h 适用范围：金属或玻璃器皿适用范围：金属或玻璃器皿4.4.

11、湿热灭菌法湿热灭菌法 利用饱和蒸汽灭菌，条件：利用饱和蒸汽灭菌，条件：121121，30min 30min 适用范围：生产设备及培养基灭菌适用范围：生产设备及培养基灭菌5.5.过滤除菌法过滤除菌法 利用过滤方法阻留微生物利用过滤方法阻留微生物 适用范围：制备无菌空气适用范围：制备无菌空气6.6.火焰灭菌法火焰灭菌法 火焰火焰 适用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口适用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口 v谷氨酸棒状杆菌的培养液常采用的灭菌方法是（谷氨酸棒状杆菌的培养液常采用的灭菌方法是（ ）A A高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌B B高温灭菌高温灭菌C C加入抗生素灭菌加入抗生素灭菌D D酒精灭菌酒精灭菌消毒

12、（消毒（disinfectiondisinfection）与灭菌（）与灭菌（sterilizationsterilization）的区别？）的区别？ 消毒是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病消毒是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物。原微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。例如，。例如，巴氏消毒法，是将物料加热至巴氏消毒法，是将物料加热至6060维持维持30min30min，以杀死不耐高温的，以杀死不耐高温的微生物营养细胞。微生物营养细胞。 灭菌是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包灭菌是用物理或化学方法杀

13、死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。括营养细胞、细菌芽孢和孢子。 消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的。消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的。 培养基的湿热灭菌培养基的湿热灭菌湿热灭菌原理湿热灭菌原理 灭菌条件灭菌条件灭菌不利方面灭菌不利方面蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时会放出大量的冷凝热，很容易使蛋白时会放出大量的冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。质凝固而杀死各种微生物。121，30min。同时会破坏培养基中的营养成分，甚同时会破坏培养基中的营养成分，甚至产生不利于菌体生长的物质至产生不利于菌体

14、生长的物质。将配制好的培将配制好的培养基养基同时放在同时放在发酵罐或其他发酵罐或其他装置中，通入装置中，通入蒸汽将培养基蒸汽将培养基和所用设备一和所用设备一起进行加热灭起进行加热灭菌的过程，也菌的过程，也称实罐灭菌。称实罐灭菌。（一）间歇灭菌（一）间歇灭菌 （常用）（常用）培养基间歇灭菌过程培养基间歇灭菌过程中的温度变化情况中的温度变化情况24016012080时间（min)050100150温度升温冷却保温过程包括：过程包括：升温、保温和冷却升温、保温和冷却三阶段。三阶段。各阶段对灭菌的各阶段对灭菌的贡献：贡献： 20%20%、75%75%、5%5%。蒸汽蒸汽（二）连续灭菌（又称连消）（二）

15、连续灭菌（又称连消） 将培养基在发酵罐外通过连续灭菌装置进行将培养基在发酵罐外通过连续灭菌装置进行加热、保温和冷却而进行灭菌。加热、保温和冷却而进行灭菌。 发酵罐发酵罐蒸汽蒸汽冷却水冷却水无菌培养基无菌培养基配料罐配料罐泵泵加热塔加热塔维持罐维持罐冷却管冷却管连续灭菌的基本设备有哪些连续灭菌的基本设备有哪些 ？问题问题连续灭菌的流程与设备连续灭菌的流程与设备（1）配料预热罐，）配料预热罐，将配制好的料液预热将配制好的料液预热到到60 70 ，以免以免连续灭菌时由于料液连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大与蒸汽温度相差过大而产生而产生水汽撞击声水汽撞击声；（2）连消塔，）连消塔，用高用高温蒸汽使

16、料液温蒸汽使料液温度很温度很快升高到灭菌快升高到灭菌(126 132 ）；（3 3）维持罐，）维持罐，使料液在灭菌温度下保持使料液在灭菌温度下保持5 5 7min7min。因为：因为：连消塔加热的时间很短，光靠这段时间连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的的灭菌是不够的；（4 4）冷却管，）冷却管，使料液使料液冷却到冷却到4040 50 50 后（冷水后（冷水喷淋）喷淋） ，输送到预先灭菌过的罐内。，输送到预先灭菌过的罐内。连续灭菌过程中温度的变化连续灭菌过程中温度的变化( (虚线虚线) ) 优 点点缺缺 点点连续灭菌菌1.1.高温短高温短时灭菌，培养基菌，培养基 营养成分养成分损失

17、少。失少。2.2.发酵罐占用酵罐占用时间缩短，短， 利用率高。利用率高。1.1.设备复复杂，操作麻，操作麻烦, , 染菌机会多。染菌机会多。2.2.不适合含大量固体物不适合含大量固体物 料的料的灭菌。菌。间歇歇灭菌菌1.1.设备要求低，不需另外要求低，不需另外 加加热、冷却装置。、冷却装置。2.2.操作要求低，适合小批操作要求低，适合小批 量生量生产规模模3.3.适合含大量固体物料的适合含大量固体物料的 灭菌菌1.1.培养基的培养基的营养物养物质损 失大，失大，灭菌后培养基菌后培养基 质量下降量下降2.2.发酵罐的利用率酵罐的利用率较低低3.3.不适合大不适合大规模生模生产的的 灭菌菌（三）间

18、歇灭菌与连续灭菌的比较（三）间歇灭菌与连续灭菌的比较第二节第二节 加热灭菌的基本原理加热灭菌的基本原理v灭灭菌菌的的方方法法虽虽然然很很多多，但但对对发发酵酵工工业业中中大大量量培培养养基基和和生生产产设设备备的的处处理理，目目前前广广泛泛采采用用蒸蒸汽汽加加热热的的方方法法进进行行灭灭菌菌。实实际际生生产产上上，蒸蒸汽汽较较易易获获得得，蒸蒸汽汽温温度度高高，冷冷凝凝时时能能放放出出大大量量的的潜潜热热，加加速速嗜嗜热热菌菌芽芽孢孢的的死死亡亡，操操作作控控制制也也较较方方便便，因因而而湿湿热热蒸蒸汽汽灭灭菌菌是是一一种种简简单单而而又又经经济济有有效效的的灭灭菌菌方方法法。v用湿热法处理培

19、养基时，在微生物被杀死的同时，培养基用湿热法处理培养基时，在微生物被杀死的同时，培养基成分也受到一定的破坏。对于灭菌的要求是既要达到杀菌成分也受到一定的破坏。对于灭菌的要求是既要达到杀菌的目的，又要使培养基成分破坏尽可能减少到最低程度。的目的，又要使培养基成分破坏尽可能减少到最低程度。因此，因此，灭菌程度灭菌程度和和营养成分的破坏营养成分的破坏成为灭菌工作中的主要成为灭菌工作中的主要矛盾，恰当掌握加热温度和受热时间是灭菌工作的关键。矛盾，恰当掌握加热温度和受热时间是灭菌工作的关键。 一、微生物的热阻一、微生物的热阻v每每一一种种微微生生物物都都有有一一定定的的生生长长温温度度范范围围。当当微微

20、生生物物处处在在最最低低限限温温度度以以下下时时，代代谢谢作作用用几几乎乎停停止止而而处处于于休休眠眠状状态态。相相反反，温温度度超超过过最最高高限限度度时时，细细胞胞中中的的原原生生质质胶胶体体和和酶酶蛋蛋白白就就发发生生不不可可逆逆的的凝凝固固变变性性，使使微微生生物物在在一一定定时时间间内内死死亡亡。加热灭菌就是根据微生物的这个特点进行的。加热灭菌就是根据微生物的这个特点进行的。v杀死微生物的极限温度称为杀死微生物的极限温度称为致死温度致死温度。在致死温度下，杀。在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间称为死全部微生物所需要的时间称为致死时间致死时间。在致死温度以。在致死温度以上，温度愈

21、高，致死时间愈短。营养细胞和细菌芽孢对热上，温度愈高，致死时间愈短。营养细胞和细菌芽孢对热的抵抗力不同。的抵抗力不同。微生物对热的抵抗力，常用微生物对热的抵抗力，常用“热阻热阻”表示。表示。热阻是指微生物在某一特定条件下的致死时间。热阻是指微生物在某一特定条件下的致死时间。二、微生物的热死原理二、微生物的热死原理对数残留定律对数残留定律v在在一一定定温温度度下下，微微生生物物的的受受热热死死亡亡符符合合单单分分子子反反应应动动力力学学。在在灭灭菌菌过过程程中中，活活菌菌数数逐逐渐渐减减少少，其其减减少少量量随随残残存存活活菌菌数数的的减减少少而而递递减减，即即微微生生物物热热死死亡亡速速率率与

22、与任任一一瞬瞬间间残残存存活活菌菌数成正比，这就是对数残留定律：数成正比，这就是对数残留定律： -dN/dt=KN 式中：式中： N残存活菌数残存活菌数；t灭菌时间灭菌时间(min)；K杀菌速率常数杀菌速率常数(min-1)，也称为反应速度常数，其大小与微生物的种类和也称为反应速度常数，其大小与微生物的种类和加热温度有关；加热温度有关；dN/dt菌的瞬时变化率，即死亡速率。菌的瞬时变化率，即死亡速率。 v 将存活率将存活率 与灭菌时间与灭菌时间t t在半对数坐标纸上标绘可在半对数坐标纸上标绘可以得到直线。以得到直线。 直线的斜率为直线的斜率为K K，K K值值越大表示微生物越容越大表示微生物越

23、容易死亡易死亡。ln嗜热脂肪芽孢杆菌嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热死速率孢子的热死速率K K值越大表示微生物越值越大表示微生物越容易死亡。容易死亡。lnK K（比热死亡速率常数）比热死亡速率常数）由两个因素决定由两个因素决定1 1、微生物的种类和存在方式、微生物的种类和存在方式2 2、灭菌温度、灭菌温度 在一定温度下，比热死亡速率常数在一定温度下，比热死亡速率常数K K随微生物种随微生物种类不同而不同。例如，在类不同而不同。例如，在121121， 枯草芽胞杆菌枯草芽胞杆菌FS5230FS5230的的K K：0.0470.0470.063s0.063s-1-1； 梭状芽胞杆菌梭状芽胞杆菌PA3679P

24、A3679的的K K：0.03 s0.03 s-1-1； 嗜热脂肪杆菌嗜热脂肪杆菌FS1518FS1518的的K K：0.013 s0.013 s-1-1。 v在恒定温度下，将方程移项积分：在恒定温度下，将方程移项积分：vN0开开始始灭灭菌菌(t=0)时时原原有有活活菌菌数数(污污染染度度)；Ns经经时时间间t后残存活菌数后残存活菌数(灭菌度，一般要求灭菌度，一般要求Ns=10-3)；v反反应应速速度度常常数数K是是判判断断微微生生物物受受热热死死亡亡难难易易程程度度的的基基本本依依据据。各各种种微微生生物物在在同同样样温温度度下下的的K值值不不同同，并并受受菌菌的的生生理理状状态态、生生长长

25、条条件件及及杀杀菌菌方方法法等等多多种种因因素素的的影影响响。K值值愈愈小小，则则此此微微生生物物愈愈耐耐热热。有有时时习习惯惯上上也也有有采采用用1/10衰衰减减时时间间D(decimal reaction time)来来表表示示的的，D值值是是活活的的微微生生物物在在受受热热过过程程中中减减少少到到原原来来数数目目的的1/10(N/N0=1/10)所所需需要要的的时时间间。D与与K成反比关系：成反比关系： v就各种微生物的热阻来说，细菌芽孢是较耐热的，孢子的就各种微生物的热阻来说，细菌芽孢是较耐热的，孢子的热阻要比生长期细胞大得多，即细菌芽孢的热阻要比生长期细胞大得多，即细菌芽孢的K K值

26、比生长期值比生长期细胞和霉菌孢子小得多。故灭菌程度要以杀死细菌的芽孢细胞和霉菌孢子小得多。故灭菌程度要以杀死细菌的芽孢为准。但对细菌芽孢来说，并不始终符合对数残留定律，为准。但对细菌芽孢来说，并不始终符合对数残留定律，特别是在受热后很短的时间内。特别是在受热后很短的时间内。 三、温度对杀菌速率常数三、温度对杀菌速率常数K的影响的影响v微微生生物物受受热热蛋蛋白白质质变变性性而而死死亡亡，这这种种反反应应属属于于单单分分子子反反应应型型，所所以以温温度度对对杀杀菌菌速速率率常常数数的的影影响响可可以以用用阿阿累累尼尼乌乌斯斯(Arrhenius)方程方程表示：表示：v K=Ae-E/RT或或ln

27、K=lnA-E/R1/T vK杀菌速率常数杀菌速率常数(min-1)；A频率因子频率因子(min-1)，因菌种不因菌种不同而异；同而异；E活化能活化能(J/mol)，其值愈大，微生物越易受热其值愈大，微生物越易受热死亡；死亡；T绝对温度绝对温度(K)，T(K)=t()+273.15；R气体常气体常数，等于数，等于8.36J/molK(或或1.98cal/molK)； 四、影响培养基灭菌的因素四、影响培养基灭菌的因素1、营养成分的保持、营养成分的保持v在在培培养养液液加加热热杀杀菌菌时时，不不仅仅杀杀死死杂杂菌菌，培培养养基基成成分分也也受受热热变变化化，尤尤其其是是维维生生素素、氨氨基基酸酸、

28、葡葡萄萄糖糖等等营营养养成成分分也也会会受受热热破破坏坏。所所以以在在灭灭菌菌过过程程中中，既既要要达达到到灭灭菌菌效效果果，又又要要考考虑尽量减少营养成分的破坏。虑尽量减少营养成分的破坏。 v培培养养基基成成分分受受热热分分解解的的反反应应也也是是属属于于一一级级反反应应，符符合合对对数数残留定律和阿氏方程：残留定律和阿氏方程： -dC/dt=KC K=Ae-E/RTv式式中中：K营营养养物物破破坏坏的的反反应应速速度度常常数数(min-1)；C营营养养物浓度物浓度(mol/L)；E营养物分解反应的活化能营养物分解反应的活化能(J/mol)v在活化能大的反应中，反应速在活化能大的反应中，反应

29、速率随温度变化也大；反之，如率随温度变化也大；反之，如果某一反应的活化能非常小，果某一反应的活化能非常小，那么该反应的速度随温度的变那么该反应的速度随温度的变化也很小。所以当温度升高时，化也很小。所以当温度升高时，杂菌死亡速度要比营养成分破杂菌死亡速度要比营养成分破坏速度快得多。根据这一道理，坏速度快得多。根据这一道理，培养基灭菌采用高温短时的方培养基灭菌采用高温短时的方法，可以减少营养成分的破坏。法，可以减少营养成分的破坏。养分虽因温度增高破坏也增加，养分虽因温度增高破坏也增加，但因灭菌时间大为缩短，总破但因灭菌时间大为缩短，总破坏量因之减少。坏量因之减少。 灭菌温度灭菌温度()()灭菌时间

30、灭菌时间( (min)min)VBVB1 1损失损失(%)(%)10010084384399.9999.9911011075758989115115151550501201207.67.627271301300.8510.85110101401400.1070.1073 31501500.0150.0151 12、微生物的耐热性、微生物的耐热性v无芽孢的细菌在无芽孢的细菌在60加热加热60min或或70加热加热5min即可杀死，即可杀死，霉菌孢子在霉菌孢子在8688加热加热3min也可杀死。但是有些细菌芽也可杀死。但是有些细菌芽孢的热阻较大，孢的热阻较大，100处理处理30min仍未杀死。仍未

31、杀死。v培养基中含有各种各样的微生物，不可能逐一地加以考虑。培养基中含有各种各样的微生物，不可能逐一地加以考虑。在灭菌计算中，如将全部微生物作为耐热的细菌芽孢来计在灭菌计算中，如将全部微生物作为耐热的细菌芽孢来计算灭菌温度和时间，这样就势必加长加热时间和提高加热算灭菌温度和时间，这样就势必加长加热时间和提高加热温度。温度。v灭菌所需要的时间取决于把活的细菌芽孢减少到所规定数灭菌所需要的时间取决于把活的细菌芽孢减少到所规定数目的时间。同时，由于一个细菌只能形成一个芽孢，故把目的时间。同时，由于一个细菌只能形成一个芽孢，故把培养基中原有芽孢细菌和细菌芽孢数之和作为计算依据较培养基中原有芽孢细菌和细

32、菌芽孢数之和作为计算依据较为合理。为合理。 3 3、pHpH值值vpHpH值值对对微微生生物物的的耐耐热热性性影影响响很很大大，pH=6.0pH=6.08.08.0时时，微微生生物物最最不不易易死死亡亡，pHpH6.06.0时时，H H+ +很很易易渗渗入入微微生生物物的的细细胞胞，从从而而改改变变细细胞胞的的生生理理反反应应，促促使使其其死死亡亡。所所以以，培培养养基基的的pHpH值值愈愈低低，所所需需的的灭灭菌菌时时间间也也愈愈短短。但但一一般般情情况况下下，微微生生物物对对培培养养基基的的pHpH值值都都有有一一定定的的要要求求，在在不不允允许许调调节节pHpH值值的的情情况况下下，就就

33、要要适适当考虑延长维持时间或提高灭菌温度。当考虑延长维持时间或提高灭菌温度。温度()孢子数(个/mL)灭菌时间(min)pH=6.15.35.04.74.512010,0008753311510,000252512131311010,000706535302410010,0007407201801501504 4、培养基成分、培养基成分v油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加生物的耐热性。高浓油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加生物的耐热性。高浓度的有机物会包于细胞周围，形成一层薄膜影响热的传入，度的有机物会包于细胞周围，形成一层薄膜影响热的传入，所以灭菌温度应较高。而高浓度的盐类所以灭菌温度应较高

34、。而高浓度的盐类(8(810%10%以上以上) )、色素、色素则削弱其耐热性，故较易灭菌。例如，大肠杆菌在水中加热则削弱其耐热性，故较易灭菌。例如，大肠杆菌在水中加热至至60606565便死亡，在便死亡，在10%10%糖液中需糖液中需7070加热加热4 46 6minmin才死亡，才死亡，在在30%30%糖液中需要糖液中需要3030minmin才死亡。才死亡。 5 5、泡沫、泡沫v培培养养基基中中发发生生的的泡泡沫沫对对灭灭菌菌极极为为不不利利，因因为为泡泡沫沫中中的的空空气气形形成成隔隔热热层层，使使热热量量难难以以渗渗透透进进去去，杀杀死死其其中中潜潜伏伏的的微微生生物物。在在分分批批灭灭

35、菌菌中中，对对极极易易起起泡泡的的培培养养基基必必须须予予以以很很好好的的控控制制。若若产产生生泡泡沫沫要要采采取取措措施施加加以以破破坏坏，如如可可加加入入少少量量消消泡泡剂剂。对对极易产生泡沫的培养基，如采用连续灭菌的方法更应注意。极易产生泡沫的培养基，如采用连续灭菌的方法更应注意。6、颗粒、颗粒v培培养养基基中中含含的的颗颗粒粒小小，容容易易灭灭菌菌，颗颗粒粒大大时时，则则难难灭灭菌菌，对对于于含含有有1mm颗颗粒粒的的培培养养基基，一一般般采采用用根根据据计计算算所所定定的的灭灭菌菌温温度度和和时时间间，而而不不必必提提高高；对对于于含含有有少少量量较较大大颗颗粒粒及及粗粗纤纤维维的的

36、培培养养基基，可可用用粗粗滤滤方方法法(不不应应影影响响培培养养基基质质量量)予予以除去。培养基结块会造成灭菌的不彻底，必须注意。以除去。培养基结块会造成灭菌的不彻底，必须注意。第三节第三节 分批灭菌的计算分批灭菌的计算一、基础条件的确定一、基础条件的确定v1、污污染染度度N0:灭灭菌菌开开始始时时，污污染染的的培培养养基基中中的的杂杂菌菌个个数数(个个/mL)，也也称称为为原原始始污污染染度度。前前已已指指出出，不不能能对对培培养养基基中中的的各各种种微微生生物物逐逐一一考考虑虑，N0应应取取原原有有芽芽孢孢细细菌菌数数和和细细菌菌芽芽孢孢数数之之和和。一一般般假假定定N0为为104106个

37、个/mL。v2、灭灭菌菌度度Ns：经经过过灭灭菌菌时时间间t后后，培培养养基基中中残残存存的的活活菌菌个个数数(个个/mL)，也也称称为为杀杀菌菌程程度度。若若要要求求灭灭菌菌后后绝绝对对无无菌菌，即即Ns=0，则则从从对对数数残残留留方方程程式式可可以以看看出出，灭灭菌菌时时间间t将将等等于于无无穷穷大大()，这这是是不不可可能能的的，也也是是不不必必要要的的。因因此此，要要设设计计一一台台杀杀菌菌设设备备，必必须须确确定定在在给给定定的的发发酵酵中中所所允允许许的的残残余余污污染染度度。也也就就是是说说，培培养养液液灭灭菌菌后后，以以在在培培养养液液中中还还残残留留一一定定的的活活菌菌数数

38、来来进进行行计计算算。工工程程上上，通通常常可可设设Ns=10-3个个/罐罐，即即微微生生物物污污染染降降低低到到被被处处理理的的1000罐罐中中只只残残留留一一个个活活微微生生物物的的程程度度，此此数数已已满满足足生生产产的的要要求求。故故实实际际计计算算时时，只只要要求求出出Ns=10-3时时的的杀杀菌菌时时间间即即可可。v3、污污染染菌菌的的热热死死特特性性：一一般般在在设设计计时时需需要要了了解解残残留留活活菌菌数数N与与杀杀菌菌温温度度T和和时时间间t的的关关系系。某某种种最最耐耐热热的的细细菌菌芽芽孢孢，在在121时时的的K值值只只有有0.4min-1。v如如用用这这个个数数值值计

39、计算算灭灭菌菌温温度度和和时时间间，将将使使温温度度和和时时间间增增高高很很多多。由由于于这这种种最最耐耐热热的的芽芽孢孢一一般般很很少少发发现现，所所以以在在灭灭菌菌计计算算时时不不是是把把所所有有细细菌菌当当作作最最耐耐热热的的芽芽孢孢来来考考虑虑，而而是是用用一一般般耐耐热热的的细细菌菌芽芽孢孢的的K值值来来计计算算这这个个过过程程。如如果果培培养养基基中中含含有有较较多多量量的的这这种种耐耐热热细细菌菌芽芽孢孢，那那么么常常规规的的121灭菌温度是不够的，要将其提高到接近灭菌温度是不够的，要将其提高到接近140方可。方可。 v通通常常设设计计时时可可设设在在115.5的的芽芽孢孢，K孢

40、孢子子=11min-1，在在115.5的的细细胞胞，K细细胞胞=10min-1。一一种种枯枯草草芽芽孢孢杆杆菌菌FS5230的的芽芽孢孢在在较较高高温温度度下下，其其K值值与温度与温度T之间具有如下关系：之间具有如下关系：vK=Ae-E/RT=7.941038e-68700/1.98T v4 4、培养罐中温度与时间的关系：、培养罐中温度与时间的关系：v少少量量培培养养液液的的杀杀菌菌，其其升升温温到到杀杀菌菌温温度度的的时时间间以以及及维维持持规规定定的的杀杀菌菌时时间间后后的的降降温温时时间间可可以以忽忽略略。但但在在大大量量培培养养液液的的分分批批灭灭菌菌时时，加加热热和和冷冷却却所所需需

41、的的时时间间相相当当长长，发发酵酵罐罐容容积积越越大大，时时间间越越长长。这这两两段段时时间间实实际际上上也也起起灭灭菌菌作作用用，不不可可忽忽视视，以以防防止止因因过过度度杀杀菌菌而而引引起起培培养养液液中中有有效效成成分分的的过过度度损损失失。所所以以，总总的的灭灭菌菌时时间间t t应应等等于于加加热热时时间间( (升升温温) )时时间间t t1 1、维持维持( (保温保温) )时间时间t t2 2和冷却和冷却( (降温降温) )时间时间t t3 3的总和。的总和。V总总=V加加+V保保+V冷冷V：灭菌准数或杀菌值，表示灭菌效果：灭菌准数或杀菌值，表示灭菌效果第四节第四节 连续灭菌及其计算

42、连续灭菌及其计算v将将培培养养基基在在罐罐外外连连续续进进行行加加热热、维维持持和和冷冷却却，然然后后进进入入发发酵酵罐罐的的杀杀菌菌方方法法就就是是连连续续灭灭菌菌法法。连连续续灭灭菌菌优优点点很很多多，例例如如可可以以采采用用高高温温短短时时，使使培培养养基基养养分分破破坏坏减减少少到到最最低低限限度度，从从而而增增加加了了生生产产率率；蒸蒸汽汽负负荷荷均均匀匀，便便于于自自动动控控制制；由由于于总总的的灭灭菌菌时时间间较较分分批批灭灭菌菌短短，缩缩短短了了发发酵酵周周期期；降降低低了了劳劳动动强强度度等等等等。因因此此，培培养养基基的的连连续续灭灭菌菌已已日日益益受受到到重重视视。v对对

43、于于粘粘度度过过高高或或固固体体成成分分较较多多的的培培养养基基，要要实实现现连连续续灭灭菌菌困困难难较较多多，主主要要是是灭灭菌菌的的均均匀匀度度与与管管道道堵堵塞塞问问题题。设设计计这这类类物物料料的的连连续续灭灭菌菌设设备备必必须须避避免免管管道道过过长长，或或尽尽可可能能将将淀淀粉质培养基先行液化。粉质培养基先行液化。一、连续灭菌流程一、连续灭菌流程v连连续续灭灭菌菌因因加加热热和和冷冷却却设设备备的的不不同同，可可有有各各种种流流程程形形式式。一一般般在在连连续续灭灭菌菌时时，应尽量采用新型的热交换设备，以缩短升温和杀菌后的冷却时间。应尽量采用新型的热交换设备，以缩短升温和杀菌后的冷

44、却时间。 v1 1、连消塔、连消塔喷淋冷却流程喷淋冷却流程v这这是是国国内内味味精精厂厂曾曾普普遍遍采采用用的的连连续续灭灭菌菌流流程程。培培养养基基用用泵泵打打入入连连消消塔塔与与蒸蒸气气直直接接混混合合，达达到到灭灭菌菌温温度度后后进进入入维维持持罐罐，维维持持一一定定时时间间后后经经喷喷淋淋冷冷却却器器冷冷却却至至一一定定温温度度后后进进入入发发酵酵罐罐。该该流流程程是是比比较较陈陈旧旧的的设设计计，设设备备较较庞庞大大；维维持持罐罐直直径径较较大大，不不能能保保证证物物料料先先进进先先出出，易易发发生生局局部部过过热热或或灭灭菌菌不不足足的的现现象象；喷喷淋淋冷冷却却管管道道很很长长，

45、对对于于粘粘度度较较高高、固固形形物物含含量量较较多多的的培培养养基基极极易易堵堵塞塞。为为了了提提高高热热量量利利用用和和节节约约冷冷却却水水，可可采采用用一一台台套套管管式式换换热热器器或或板板式式换换热热器器置置于于维维持持罐罐及及冷冷却却器器中间，使生培养基与热培养基先进行一次热交换，得到预热后再进入连消塔。中间，使生培养基与热培养基先进行一次热交换，得到预热后再进入连消塔。 2.2.喷射加热喷射加热- -真空冷却流程真空冷却流程 生生培培养养液液先先用用泵泵打打入入喷喷射射加加热热器器，以以较较高高速速度度自自喷喷咀咀喷喷出出，借借高高速速流流体体的的抽抽吸吸作作用用与与蒸蒸汽汽混混

46、合合后后进进入入管管道道维维持持器器，经经一一定定时时间间后后通通过过一一膨膨胀胀阀阀进进入入真真空空闪闪急急蒸蒸发发室室，因因真真空空作作用用使使水水分分急急剧剧蒸蒸发发而而冷冷却却，再再进进入入发发酵酵罐罐冷冷却却到到接接种种温度。优点：加热和冷却在瞬间完成，营养成份破坏少。温度。优点：加热和冷却在瞬间完成，营养成份破坏少。2.2.薄板换热器连续灭菌流程薄板换热器连续灭菌流程 被被广广泛泛应应用用于于食食品品、发发酵酵、制制药药、化化工工部部门门作作为为加加热热、冷冷却却或或灭灭菌菌之之用用。如如：啤啤酒酒厂厂用用于于麦麦芽芽汁汁冷冷却却，果果酒酒厂厂用用做做葡葡萄萄酒酒灭灭菌菌和和冷冷却

47、却。优优点点：设设备备紧紧凑凑、占占地地面面积积小小、拆拆洗洗方方便便、传传热热面面积积和和传传热热系系数数高高、不不使使热热敏敏性性物物料料产产生生局局部部过热现象等。过热现象等。 生生培培养养基基进进入入板板式式换换热热器器的的加加热热段段与与熟熟培培养养液液进进行行一一次次热热交交换换达达到到预预热热，然然后后进进入入加加热热段段加加热热到到灭灭菌菌温温度度后后引引入入维维持持器器保保温温。同同时时可可再再次次用用于于预预热热，并并自身冷却。自身冷却。二、连续灭菌计算二、连续灭菌计算v连连续续灭灭菌菌过过程程中中，加加热热和和冷冷却却所所需需时时间间极极短短，为为简简化化计计算算，可以把

48、加热和冷却阶段的灭菌效果略去不计。可以把加热和冷却阶段的灭菌效果略去不计。v直直接接蒸蒸汽汽连连续续灭灭菌菌设设备备的的温温度度与与时时间间的的关关系系，取取决决于于所所涉涉及及的的实实际际灭灭菌菌问问题题，由由于于受受热热时时间间短短，温温度度可可升升高高至至140140而而不不致致严严重重破破坏坏培培养养基基。采采用用连连消消塔塔时时可可在在20203030S S达到预定灭菌温度，由维持罐来保持必要的杀菌时间；达到预定灭菌温度，由维持罐来保持必要的杀菌时间；v灭灭菌菌温温度度和和时时间间应应根根据据培培养养基基的的性性质质和和污污染染程程度度来来决决定定。例例如如，谷谷氨氨酸酸发发酵酵培培

49、养养基基粘粘度度低低、营营养养丰丰富富，故故灭灭菌菌温温度度可可低低些些，目目前前生生产产上上一一般般多多采采用用110110115115保保温温8 81010minmin。灭灭菌菌时时间间主主要要是是维维持持段段( (维维持持罐罐或或维维持持管管) )中中停停留留的的时时间间 。v如如果果已已知知原原始始污污染染度度N N0 0以以及及在在灭灭菌菌温温度度下下微微生生物物死死亡亡反反应应的的速速度度常常数数K K，略略去去加加热热和和冷冷却却阶阶段段的的灭灭菌菌效效果果，则则根根据据式式 就就可可以以求求出出连连续续灭灭菌菌过过程程所所需需的的维维持持时时间间t t2 2，根根据据流流量量和

50、和维持时间维持时间t t2 2可定出维持罐的装料容积。可定出维持罐的装料容积。v例例题题一一台台连连续续灭灭菌菌设设备备流流量量Q=6m3/h，发发酵酵罐罐装装料料容容积积40m3，原原始始污污染染度度105个个/mL，要要求求灭灭菌菌程程度度Ns=10-3，灭灭菌菌温温度度T=125，此此时时的的K=11min-1。试求维持时间试求维持时间t2及维持罐的装料容积及维持罐的装料容积V约需多少约需多少?v解解 N0=(40106)105=41012v 每分钟灭菌物料体积（维持容积）每分钟灭菌物料体积（维持容积） V=（Q/60）t2=(6/60)3.26=0.326m3v罐罐式式维维持持器器不不

51、能能保保证证物物料料先先进进先先出出，所所以以如如果果采采取取以以上上计计算算所所得得的的维维持持时时间间和和容容积积，则则可可能能有有一一部部分分物物料料未未达达到到所所要要求求的的灭灭菌菌程程度度而而过过早早流流出出，为为了安全起见并根据实践经验采用维持时间了安全起见并根据实践经验采用维持时间t2=5min，则：则：v V=(6/60)5=0.5m3 2 2、维持管、维持管v管道维持器的设计，不但要保证所要求的维持时间，而且管道维持器的设计，不但要保证所要求的维持时间，而且要使物料在管道中的流动形式尽量接近活塞流，即管道截要使物料在管道中的流动形式尽量接近活塞流，即管道截面各点的流动速度相

52、等。在这种情况下，液体在维持段平面各点的流动速度相等。在这种情况下，液体在维持段平均停留时间恰好等于所有培养基的受热时间，故能避免因均停留时间恰好等于所有培养基的受热时间，故能避免因局部过热而造成营养成分破坏或灭菌不足的现象。局部过热而造成营养成分破坏或灭菌不足的现象。 第五节第五节 灭菌问题的讨论灭菌问题的讨论一、培养基的灭菌条件一、培养基的灭菌条件v是是采采用用分分批批灭灭菌菌，还还是是采采用用连连续续灭灭菌菌，这这与与培培养养基基的的性性质质有很大关系。有很大关系。v在在氨氨基基酸酸发发酵酵中中，大大容容积积的的培培养养基基采采用用连连续续法法消消毒毒比比间间歇歇法消毒更为优越。法消毒更

53、为优越。v在在抗抗生生素素发发酵酵中中，间间歇歇法法也也许许是是可可行行的的，因因为为要要使使用用不不溶溶性性的的培培养养基基成成分分，如如黄黄豆豆饼饼粉粉或或碳碳酸酸钙钙等等。而而氨氨基基酸酸发发酵酵则则采采用用可可溶溶性性成成分分，例例如如朊朊、甜甜菜菜糖糖蜜蜜、淀淀粉粉水水解解液液或或黄黄豆饼粉水解液，因此，可以有效地使用连消装置。豆饼粉水解液，因此，可以有效地使用连消装置。v采采用用连连消消法法的的优优点点是是节节能能，消消毒毒效效果果好好，易易控控制制，有有利利于于提提高高产产率率。不不过过，国国外外通通过过改改进进发发酵酵罐罐结结构构使使得得大大罐罐也也多多采用分批灭菌的方法值得重

54、视。采用分批灭菌的方法值得重视。v另另一一个个需需要要探探讨讨的的问问题题，是是必必须须考考虑虑加加热热和和冷冷却却阶阶段段的的灭灭菌菌效效果果。在在培培养养基基灭灭菌菌过过程程中中，往往往往只只是是注注意意到到消消毒毒持持续续阶阶段段的的灭灭菌菌效效果果，而而忽忽视视了了对对加加热热和和冷冷却却阶阶段段效效果果的的估估算算。这这种种不不对对整整个个加加热热持持续续和和冷冷却却过过程程的的热热效效应应进进行行综综合合考考虑虑的的做做法法，有有时时会会导导致致灭灭菌菌蒸蒸汽汽用用量量过过高高乃乃至至培培养养基基有有效效成成分分严严重重破破坏坏。对对赖赖氨氨酸酸培培养养基基消消毒毒情情况况的的分分

55、析析表表明明，通通常常采用的灭菌条件其灭菌作用大于实际需要的采用的灭菌条件其灭菌作用大于实际需要的10倍。倍。v计算和实验都表明：计算和实验都表明：v(1)(1)随随着着灭灭菌菌温温度度的的提提高高，维维持持阶阶段段所所需需时时间间相相应应缩缩短短，因因此此灭灭菌菌周周期期缩缩短短。同同时时，随随着着温温度度的的提提高高，加加热热和和冷冷却却阶段的灭菌作用也会增加。阶段的灭菌作用也会增加。v(2)(2)灭菌温度越高，三阶段的灭菌准数之和越高。灭菌温度越高，三阶段的灭菌准数之和越高。v(3)(3)较较低低的的灭灭菌菌温温度度需需要要采采用用较较长长的的灭灭菌菌时时间间，这这会会对对培培养基的营养

56、成分产生不利影响。养基的营养成分产生不利影响。vV总总=V加加+V维维+V冷冷v二、加热灭菌的某些技术要点二、加热灭菌的某些技术要点v与与传传统统酿酿造造业业有有所所不不同同，现现代代新新型型发发酵酵工工业业一一般般都都要要求求纯纯种种培培养养，在在发发酵酵过过程程中中绝绝不不允允许许有有其其他他杂杂菌菌侵侵入入，而而只只能能让让生生产产菌菌株株在在培培养养基基内内生生长长繁繁殖殖。要要做做到到这这一一点点，除除保保证证菌菌种种的的纯纯种种外外，培培养养基基、种种子子与与发发酵酵设设备备、空空气气净净化化系系统统、接接种种补补料料操操作作等等都都需需要要灭灭菌菌。理理想想的的灭灭菌菌温温度度和

57、和时时间间应应该该既能杀死杂菌，又能最大限度地保持培养基的营养成分。既能杀死杂菌，又能最大限度地保持培养基的营养成分。v灭灭菌菌温温度度和和时时间间的的选选择择与与培培养养基基的的质质量量、杂杂菌菌浓浓度度、杂杂菌菌种种类类、培培养养基基pH值值等等有有关关。例例如如，谷谷氨氨酸酸培培养养基基不不含含悬悬浮浮状状固固体体，葡葡糖糖对对热热敏敏感感，故故应应在在保保证证杀杀菌菌完完全全的的前前提提下下，取取较较低低的的杀杀菌菌温温度度(110左左右右)有有利利。培培养养基基灭灭菌菌时时，一一般般选选定定培培养养基基中中杂杂菌菌浓浓度度为为106个个/mL，并并假假定定全全部部为为耐耐热热细细菌菌

58、的的芽芽孢孢，而而实实际际上上杂杂菌菌浓浓度度一一般般仅仅为为103个个/mL，并并只只有有少少部部分分孢孢子子。所所以以，灭灭菌菌时时间间和和温温度度可可根根据据实实际际经经验验适适当缩短。当缩短。v在灭菌过程中，蒸汽使用得当与否是灭菌成败的关键。对在灭菌过程中，蒸汽使用得当与否是灭菌成败的关键。对于与发酵罐相连的管道，必须掌握于与发酵罐相连的管道，必须掌握“不进则出不进则出”的原则，的原则，即与发酵罐相连的所有管道，在灭菌时或者是进入蒸汽或即与发酵罐相连的所有管道，在灭菌时或者是进入蒸汽或者是排出蒸汽，而不能存在既不进汽又不排汽的死角。同者是排出蒸汽，而不能存在既不进汽又不排汽的死角。同时要注意控制好各进汽口和排汽口的蒸汽量，保证各路进时要注意控制好各进汽口和排汽口的蒸汽量，保证各路进汽、排汽口都畅通，严防实质上的死角存在。特别要注意，汽、排汽口都畅通，严防实质上的死角存在。特别要注意，由于各进汽口的高低位置不同，进汽所受的阻力也不一样，由于各进汽口的高低位置不同，进汽所受的阻力也不一样，这就会造成部分管道进汽不足的现象。这就会造成部分管道进汽不足的现象。分批灭菌的操作