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1、植物基因组植物基因组DNADNA的提取的提取及纯度与含量的测定及纯度与含量的测定实验八实验八第一部分第一部分植物基因组植物基因组DNADNA的提取的提取一、实验目的和要求一、实验目的和要求1 1、学习并掌握植物基因组、学习并掌握植物基因组DNADNA的提取原理和方法；的提取原理和方法；2 2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作；、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作；3 3、学习并掌握对电泳检测基因组、学习并掌握对电泳检测基因组DNADNA结果的初步分析。结果的初步分析。二、二、实验根本原理根本原理 植物基因植物基因组DNADNA的提取方法就其提取原理主要有二种：十六的提取方法就其提取原
2、理主要有二种：十六烷基三乙基溴基三乙基溴化化铵CTAB)CTAB)法、十二法、十二烷基硫酸基硫酸钠 (SDS) (SDS)法。十六法。十六烷基三甲基溴化基三甲基溴化铵和十二和十二烷基硫酸基硫酸钠等离子型外表活性等离子型外表活性剂，能溶解，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使而使DNADNA得以游离出来。再参与苯酚和得以游离出来。再参与苯酚和氯仿等有机溶仿等有机溶剂，能使蛋白量，能使蛋白量变性，并性，并使抽提液分相，因核酸使抽提液分相，因核酸(DNA(DNA、RNA)RNA)水溶性很水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除离心后即可从抽提液中除去去细胞碎片和大
3、部分蛋白胞碎片和大部分蛋白质。上清液中参与无水乙醇使。上清液中参与无水乙醇使DNADNA沉淀，沉淀沉淀，沉淀DNADNA溶于溶于TETE溶液中，即得植物基因溶液中，即得植物基因组 DNA DNA溶液。溶液。 由于植物中的次生代由于植物中的次生代谢产物物多酚多酚类化合物可介化合物可介导DNADNA降解，而多糖的降解，而多糖的污染也是影响植物核酸染也是影响植物核酸纯度最常度最常见的的问题，这些多糖能抑制限制些多糖能抑制限制酶、衔接接酶及及DNADNA聚合聚合酶等分子生物学等分子生物学酶类的生物活性。的生物活性。传统的的CTAB-DNACTAB-DNA提取法步提取法步骤多，多，较烦琐，DNADNA产
4、率低，而且由于酚很率低，而且由于酚很难完全去除，容易影响以后的完全去除，容易影响以后的酶切等任切等任务的的效率。效率。SDSSDS法操作法操作简单，温暖，温暖, ,也可提取到也可提取到较高分子量高分子量DNADNA，但所得，但所得产物含糖物含糖类杂质较多多, ,这将直接影响将直接影响DNADNA的限制性核酸内切的限制性核酸内切酶酶切效果。由于植物切效果。由于植物细胞匀胞匀浆含有多种含有多种酶类( (尤其是氧化尤其是氧化酶类) )对DNADNA的抽提的抽提产生不利的影响，在抽提生不利的影响，在抽提缓冲液冲液中需参与抗氧化中需参与抗氧化剂或或强复原复原剂( (如如巯基乙醇基乙醇) )以降低以降低这
5、些些酶类的活性。的活性。 本本实验采用十二采用十二烷基硫酸基硫酸钠 (SDS) (SDS)法提取植物基因法提取植物基因组DNADNA，基因，基因组DNADNA提取提取后，后， 经过琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳泳鉴定基因定基因组DNADNA分子量大小、分子量大小、纯度；度；用紫外吸收用紫外吸收法法测定基因定基因组DNADNA纯度与含量。度与含量。DNADNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定的琼脂糖凝胶电泳鉴定: : DNA DNA分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。DNADNA分子在高于等电分子在高于等电点的溶液中带负电荷，它在电场中向正极挪动。在一定的电场强度下，
6、点的溶液中带负电荷，它在电场中向正极挪动。在一定的电场强度下，DNADNA分分子的迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同的相对分子量的子的迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同的相对分子量的DNADNA片段泳动速片段泳动速度不同。度不同。DNADNA片断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭片断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭EBEB染色后，染色后，在紫外光下可见橙红色带，并可确定在紫外光下可见橙红色带，并可确定DNADNA片断在凝胶中的位置。片断在凝胶中的位置。影响影响DNADNA泳泳动速率迁移率的要素有：速率迁移率的要素有： DNA DNA分子分子质量的影响：双量的影响：双链DNAD
7、NA分子迁移的速率与分子迁移的速率与DNADNA分子量分子量对数成反比。分数成反比。分 子量越大，迁移率越小。子量越大，迁移率越小。 DNA DNA构型的影响：超螺旋构型的影响：超螺旋DNADNA线状状DNADNA开开环DNADNA 胶胶浓度的影响：度的影响： 浓度越低，一度越低，一样核酸分子迁移越快，普通常用的凝胶核酸分子迁移越快，普通常用的凝胶浓度度 为1 12 2； 电场强度的影响：度的影响：电场强度愈大，度愈大，带点点颗粒的泳粒的泳动越快。但凝胶的有效分越快。但凝胶的有效分 离范离范围随着随着电压增大而减小，所以增大而减小，所以电泳泳时普通采用低普通采用低电压，普通，普通5V/cm5V
8、/cm 电场强度度 。而。而对于大片段于大片段电泳，甚至用泳，甚至用0.50.51.0V/cm1.0V/cm电泳泳过夜。夜。进展展 高高压电泳泳时，只能运用聚丙，只能运用聚丙烯酰胺凝胶。胺凝胶。 EB EB的影响：溴化乙的影响：溴化乙锭EBEB插入双插入双链DNADNA呵斥其呵斥其负电荷减少、荷减少、刚性和性和长度增度增 加。加。 电泳泳缓冲液的影响冲液的影响: :核酸核酸电泳常采用泳常采用TAETAE、TBETBE、TPETPE三种三种缓冲系冲系统，但它，但它们 各有利弊。各有利弊。TAETAE价价钱低廉，但低廉，但缓冲才干低，必需冲才干低，必需进展两极展两极缓冲液的循冲液的循环。 TPE
9、TPE在在进展展DNADNA回收回收时，会使，会使DNADNA污染磷酸染磷酸盐，影响后，影响后续反响。所以多采用反响。所以多采用 TBE TBE缓冲液。在冲液。在缓冲液中参与冲液中参与EDTAEDTA，可以，可以鳌合二价离子，抑制合二价离子，抑制DNaseDNase，维护 DNA DNA。缓冲液冲液pHpH常偏碱性或中性，此常偏碱性或中性，此时核酸分子核酸分子带负电，向正极挪，向正极挪动。 碱基碱基组成与成与电泳温度的影响泳温度的影响: : 普通影响不大普通影响不大在在DNADNA提取提取过程中必需一直留意以下几个关程中必需一直留意以下几个关键问题：1 1DNADNA的二的二级构造和双构造和双
10、链易受多种要素如易受多种要素如强酸、酸、强碱、加碱、加热、低、低盐浓度、度、有机溶有机溶剂、酰胺胺类、尿素等的影响引起双、尿素等的影响引起双链解开，即解开，即“变性，因此抽提性，因此抽提时防止运用防止运用变性的条件。性的条件。2 2抑制内外源抑制内外源DNaseDNase的活力。的活力。DNaseDNase就象一把刀，它能把大分子的就象一把刀，它能把大分子的DNADNA切成碎切成碎片，所以要加以杜片，所以要加以杜绝，现可以可以经过多种途径来做到多种途径来做到这一点：一点：a a、低温操作；、低温操作；b b、调理理pHpH，使偏碱，使偏碱pH8.0pH8.0；c c、抽提液中加外表活性、抽提液
11、中加外表活性剂；d d、加螯合、加螯合剂EDTAEDTA除去除去酶的的铺助因子助因子Mg2+Mg2+，使，使酶活性活性丧失。失。3 3防止化学降解。如防止化学降解。如过酸或酸或过碱以及其它化学要素，会使碱以及其它化学要素，会使DNADNA降解，普通降解，普通综合思索，取合思索，取pH8.0pH8.0左右左右为宜。宜。4 4防止物理要素降解。如温度太高或机械防止物理要素降解。如温度太高或机械张力剪切等，力剪切等，DNADNA分子特分子特别大，极大，极易被机械易被机械张力拉断，甚至在力拉断，甚至在细管中稍急一些的流管中稍急一些的流动也会使也会使DNADNA断裂，所以在抽断裂，所以在抽提提过程中要特
12、程中要特别留意留意这一点，操作一点，操作过程要尽量程要尽量简便、温暖、减少便、温暖、减少搅拌次数，也拌次数，也不要猛烈不要猛烈摇动。5 5植物的次生代植物的次生代谢物主要是胞物主要是胞质内的多酚内的多酚类或色素或色素类化合物化合物对核酸提核酸提取有干取有干扰作用。因此，普通尽能作用。因此，普通尽能够选幼嫩的、代幼嫩的、代谢旺盛的新生旺盛的新生组织作作为提取提取DNADNA的的资料，料，这是因幼嫩的新生是因幼嫩的新生组织次生代次生代谢物物较少，少，DNADNA含量高，且易于破碎，含量高，且易于破碎，植物植物资料最好是新料最好是新颖的。的。三、三、实验资料与料与试剂1 1、实验资料：植物幼嫩叶子料
13、：植物幼嫩叶子2 2、实验试剂1 1基因基因组DNADNA提取提取缓冲液冲液2 2氯仿仿: :异戊醇异戊醇: :乙醇抽提液乙醇抽提液3 3TETE缓冲液冲液4 4平衡酚：平衡酚：5 5RNARNA酶A A6 6酚酚/ /氯仿仿7 7氯仿仿/ /异戊醇异戊醇8 8异丙醇、无水乙醇、异丙醇、无水乙醇、70%70%乙醇。乙醇。9 9 3mol/L NaAc 3mol/L NaAc1010 5TBE 5TBE缓冲液冲液1111 6 6电泳上泳上样缓冲液冲液1212 1.0% 1.0%琼脂糖凝胶脂糖凝胶1313 EB EB14 DNA分子量Markers： 125，564，2027，2322，4361，
14、6557，9416，23130bp.四、四、实验器材与器材与仪器器1 1、研体、研体2 2、离心机、离心管、离心机、离心管7ml7ml及离心管架；及离心管架；3 3、微量移液器：、微量移液器：10ul10ul、1000ul1000ul；4 4、恒温水浴箱、恒温水浴箱65 65 5 5、制冰机；、制冰机；6 6、冰箱；、冰箱； 7 7、恒温水浴箱、恒温水浴箱 37 37；8 8、微波炉；、微波炉； 9 9、电泳泳仪及及电泳槽；泳槽；1010、紫外、紫外检测仪。五、实验操作方法和步骤五、实验操作方法和步骤 置于预热到65的研体中，加少许石英砂；参与预热到65的核酸提取缓冲液3 ml称取植物幼嫩叶子
15、0.5g迅速研成匀浆转移到7ml带盖离心管中65水浴保温40 min，其间经常轻柔摇动参与3 ml氯仿-异戊醇溶液轻柔颠倒混匀后，室温静置分层5 min离心12000rpm5min上清液转移到干净7ml离心管中，记录体积，弃沉淀，*参与等体积异丙醇试剂，混和后静置20 min沉淀DNA4离心5,000g3 min搜集絮状沉淀参与3mlTE，65水浴中助溶15min，使之完全溶解参与等体积的平衡酚，轻柔颠倒混匀，室静置10min4离心12,000rpm10min转移上清于新7ml离心管中，记录体积*参与等体积的酚氯仿，轻柔颠倒混匀，室温放置15min4离心12,000rpm，5min汲取上清转移
16、到一新7ml离心管中，记录体积*参与等体积的氯仿，颠倒混匀，室温放置5min4离心12,000rpm，10min汲取上清转移到一新7ml离心管中，记录体积*参与1/10体积3mol/L NaAC和2体积20预冷的无水乙醇20放置20 min *4离心 12,000rpm ，10min搜集沉淀* 用70%乙醇洗涤沉淀，倾倒掉乙醇溶液，枯燥，让酒精完全挥发用1ml TE 溶解沉淀，参与5l RNase5g/l，37 保温10 min，即为植物基因组DNA溶液*凝胶电泳检测基因组DNA分子量大小、纯度阐明：假设蛋白质和RNA未去除干净，反复酚，酚/氯仿，氯仿抽提步骤，继续用RNase 处置，乙醇沉淀
17、和洗涤，重溶于TE中，直至基因组DNA纯度和质量符合要求。一一 植物基因组植物基因组DNADNA的提取的提取 紫外吸收法测定基因组DNA纯度与含量* *植物基因组植物基因组DNADNA的提取操作过程景象的提取操作过程景象* *植物基因组植物基因组DNADNA的提取操作过程景象的提取操作过程景象1、制胶1琼脂糖凝胶 在胶模上架好梳子。称取01g琼脂糖，置于250ml锥形瓶中，加100ml 0.5TBE电泳缓冲液，加热熔化至无颗粒状琼脂糖，待其冷却至5060后，参与EB，使其终浓度为0.5mg/L，摇匀后立刻倒入预备好的胶模中，待胶凝固后，放入电泳槽中，倒入适量0.5TBE刚好淹过胶面，拔去梳子备
18、用。注：EB为诱变剂、致癌物，接触凝胶必需戴手套操作2、加样 取5ul纯化的DNA原溶液样品，与1ul 6电泳加样缓冲液混匀，用微量移液枪小心参与样品槽中注：勿划破或戳穿加样孔，勿带入气泡。假设DNA含量偏低，那么可依上述比例添加上样量，但总体积不可超越样品槽容量。每加完一个样品要换枪头以防相互污染。留意上样时要小心操作，防止损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。3、电泳 加完样后，盖上电泳槽盖，立刻接通电源，使电压调到100V，恒压电泳。当溴酚蓝条带挪动到距凝胶前缘约2cm时，停顿电泳约需3060min。4、察看和拍照 取出胶块置于紫外灯下察看，DNA存在处可显示出肉眼可辨的橘红色荧光带，再用成像
19、仪进展拍照，以便于分析。注：紫外光对眼睛有害，察看时戴上防护镜或眼镜，或隔着玻璃或有机玻璃察看。二琼脂糖凝胶电泳检测基因组二琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNADNA第二部分第二部分基因组基因组DNADNA纯度与含量的测定纯度与含量的测定一、实验目的和要求一、实验目的和要求1 1、学习紫外吸收法测定核酸根本原理和方法；、学习紫外吸收法测定核酸根本原理和方法；2 2、学习并掌握紫外吸收法测定基因组、学习并掌握紫外吸收法测定基因组DNADNA纯度与含量的方法。纯度与含量的方法。二、二、实验根本原理根本原理 核酸核酸DNADNA和和RNARNA所含碱基的苯所含碱基的苯环构造构造嘌呤呤环和和嘧啶环的共的共轭
20、双双键具具有紫外吸收的性有紫外吸收的性质，它，它们在在260nm260nm处有最大的吸收峰。因此，可以用有最大的吸收峰。因此，可以用260nm260nm波出波出息展核酸含量的息展核酸含量的测定。定。 波波长为260nm260nm时，DNADNA或或RNARNA的光密度的大小不的光密度的大小不仅与与总含量有关，也与它含量有关，也与它们的不同构型而有差的不同构型而有差别。 对规范范样品来品来说，浓度度为1g / ml1g / ml时，DNADNA钠盐的的OD260OD2600.020.02。 当当OD260OD2601 1时，双，双链DNADNA含量含量约为50g / ml50g / ml 单链D
21、NADNA含量含量约为37g / ml37g / ml RNA RNA含量含量约为40g / ml40g / ml 寡核苷酸含量寡核苷酸含量约为30g / ml30g / ml由于底物不由于底物不同有差同有差别1 1、核酸、核酸样品品DNADNA、RNARNA含量的含量的测定：定： 如用如用1cm1cm光径石英比色皿，用光径石英比色皿，用 H2O H2O稀稀释DNADNA或或RNARNA样品品n n倍并以倍并以H2OH2O为空白空白对照，根据此照，根据此时读出的出的OD260OD260值即可即可计算出算出样品稀品稀释前前DNADNA的含量：的含量： DNA DNAg/lg/l=50OD260=
22、50OD260读数数 DNA DNA样品稀品稀释倍数倍数/1000/1000 RNA RNAg/lg/l=40OD260=40OD260读数数 RNA RNA样品稀品稀释倍数倍数/1000/1000 假假设样品不品不纯，那么比，那么比值发生生变化，此化，此时无法用分光光度法无法用分光光度法对核酸核酸进展定展定量，可运用溴化乙量，可运用溴化乙锭法或其他方法法或其他方法进展估算。展估算。 当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。由于 DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子那么集中在230nm处。所以，普通情况下同时
23、检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算它们的比值来判别核酸样品的纯度。2、核酸样品纯度判别的普通规范： DNA纯度：OD260/OD2801.8，表示为纯的DNA； OD260/OD280 1.9，表示有RNA污染； OD260/OD280 1.6，表示有蛋白质、酚等污染。 RNA纯度：1.7 OD260/OD2802.0，表示为纯的RNA； OD260/OD280 1.7时，表示有蛋白质或酚污染； OD260/OD280 2.0时，表示能够有异硫氰酸残存。 OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，假设比值较高阐明有剩余的盐和小分子如核苷酸、氨基酸、酚等的存在。 假
24、设样品不纯，那么比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进展定量；同时也会影响酶切和PCR的效果。三、三、实验资料与料与试剂1 1、实验资料料 植物基因植物基因组DNADNA样品品2 2、实验试剂 ddH2O ddH2O； TE TE缓冲液冲液pH 8.0pH 8.0。四、四、实验器材与器材与仪器器1 1、离心机、离心管、离心机、离心管5ml5ml及离心管架；及离心管架；2 2、微量移液器、微量移液器10ul10ul、200ul200ul、1000ul1000ul及及枪头；3 3、紫外分光光度、紫外分光光度计；4 4、石英比色皿、石英比色皿0.5cm0.5cm光径或光径或1cm1cm光径的微量
25、石英比色皿光径的微量石英比色皿50ul50ul、100ul100ul。五、实验操作方法和步骤五、实验操作方法和步骤 方法方法1 1： 将提取的植物基因组将提取的植物基因组DNADNA样品汲取样品汲取20ul20ul，加到新的，加到新的5ml5ml离心管中，再加一定离心管中，再加一定量的量的ddH2O ddH2O 或或TETE缓冲液缓冲液pH 8.0pH 8.0稀释稀释100100倍，用倍，用0.5cm0.5cm光径石英比色皿约光径石英比色皿约需需1.6ml1.6ml样品溶液或微量石英比色皿在紫外分光光度计上测定样品溶液或微量石英比色皿在紫外分光光度计上测定230nm230nm、260nm260
26、nm、280nm280nm处的吸光度。计算植物基因组处的吸光度。计算植物基因组DNADNA样品溶液的样品溶液的DNADNA的含量以及的含量以及DNADNA样品的样品的纯度。纯度。 方法方法2 2： 直接取植物基因组直接取植物基因组DNADNA样品微量原液样品微量原液1 12ul)2ul)，用分光光度计进展自动，用分光光度计进展自动测定出测定出230nm230nm、260nm260nm、280nm280nm处的吸光度值，计算植物基因组处的吸光度值，计算植物基因组DNADNA样品溶液的样品溶液的DNADNA的含量以及的含量以及DNADNA样品的纯度。样品的纯度。 用TE调0空白： 取植物基因组DN
27、A样品原液12ul，进展自动测定230nm、260nm、280nm处的吸光度值：六、六、计算算1 1、植物基因、植物基因组DNADNA样品溶液的品溶液的DNADNA的含量：的含量： DNA DNAg/l g/l = 50OD260= 50OD260读数数2*DNA2*DNA样品稀品稀释倍数倍数/1000/1000 * * 用用0.5cm0.5cm光径石英比色皿光径石英比色皿2 2 ，用，用1cm1cm光径石英比色皿光径石英比色皿11。2 2、植物基因、植物基因组DNADNA样品溶液的品溶液的DNADNA的的纯度：度： OD260/OD280 OD260/OD280 OD230/OD260 OD230/OD260 3 3、样品品纯度判度判别： OD260/OD280 1.8 OD260/OD280 1.8，表示，表示为纯的的DNADNA； OD260/OD280 OD260/OD280 1.91.9，表示有，表示有RNARNA污染；染； OD260/OD280 OD260/OD280 1.61.6，表示有蛋白，表示有蛋白质、酚等、酚等污染。染。七、结果分析讨论七、结果分析讨论下下 次次 实实 验验 课课自主自主设计实验与与实际 开开题报告告递交：交： 及及“实验药品、器材和品、器材和仪器需量申器需量申领表表
