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1、DDRT-PCRDDRT-PCR技术及应用的研技术及应用的研究进展究进展 前言前言基因在不同组织细胞的不同基因在不同组织细胞的不同生长阶段的选择性表达决定生长阶段的选择性表达决定了生物的整个生命过程了生物的整个生命过程个体的生长、发育、细胞周个体的生长、发育、细胞周期的调控、衰老及细胞的程期的调控、衰老及细胞的程序性死亡等。因此分离、鉴序性死亡等。因此分离、鉴定差异表达的基因，研究基定差异表达的基因，研究基因转录对了解生命过程的机因转录对了解生命过程的机理、发现具有特殊功能的表理、发现具有特殊功能的表达产物有着重要的意义。达产物有着重要的意义。 DDRTPCR早期，从早期，从mRNAmRNA转
2、录水平筛选差异表达基因的方法转录水平筛选差异表达基因的方法是是差别筛选技术差别筛选技术和和扣除杂交法扣除杂交法，但二者存在灵敏，但二者存在灵敏度低、工作量大、周期长及步骤繁琐的问题。度低、工作量大、周期长及步骤繁琐的问题。哈佛大学医学院哈佛大学医学院Liang Liang 和和StrussStruss 博士发明了博士发明了mRNAmRNA差异显示技术差异显示技术，即，即DDRTDDRTPCR(differPCR(differentialential display of mRNA by PCR)display of mRNA by PCR)。 19941994年，年，ErricErric Ha
3、ayHaay等将这种方法正式命名为差等将这种方法正式命名为差异显示反转录聚合酶链式反应异显示反转录聚合酶链式反应(mRNA (mRNA Differential Display PCR)Differential Display PCR)，简称，简称DDRTPCR DDRTPCR mRNAmRNA差异显示技术的基本原理及实验步骤差异显示技术的基本原理及实验步骤 1.1 mRNA1.1 mRNA差异显示技术的基本原理差异显示技术的基本原理 首先，用首先，用33端锚定引物端锚定引物(Anchor (Anchor Primer)(dTPrimer)(dT) VN) VN作为反转录引物反转录细胞总作为反
4、转录引物反转录细胞总mRNAmRNA，合成第一链，合成第一链cDNAcDNA； 然后，在用放射性同位素标记的然后，在用放射性同位素标记的dNTPdNTP存在的存在的情况下，用随机引物情况下，用随机引物(Arbitrary Primer)(Arbitrary Primer)和与和与反转录引物相同的锚定引用进行反转录引物相同的锚定引用进行PCRPCR，随机扩，随机扩增增cDNAcDNA片段；片段； 将将PCRPCR产物在变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳产物在变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，通过放射自显影展示并回收多态分离，通过放射自显影展示并回收多态cDNAcDNA片片段段( (即即EST)EST)；
5、将差异带二次将差异带二次PCRPCR扩扩增并通过增并通过NorthernNorthern杂交来验证、克隆、杂交来验证、克隆、测序差异测序差异cDNAcDNA片段。片段。将所得片段用将所得片段用BLASTBLAST与与GenGenBankBank数据库数据库内的已知序列做比内的已知序列做比较，确定片段是否较，确定片段是否是新序列是新序列( (基因基因) )。 2 mRNA2 mRNA差异显示技术的优点和缺点差异显示技术的优点和缺点 1 优点优点 周期短，操作简便，省去了周期短，操作简便，省去了cDNAcDNA克隆和随后的克隆和随后的克隆筛选工作，比递减杂交要迅速；克隆筛选工作，比递减杂交要迅速；
6、 可同时比较可同时比较2 2个以上时空特异性及物种特异性表个以上时空特异性及物种特异性表达基因；达基因； 灵敏度高，所需灵敏度高，所需RNARNA的量少，该法用的量少，该法用PCRPCR扩增，扩增，每做每做100100个反应只需个反应只需1 1 IxgIxg mRNA mRNA，而递减杂交则需，而递减杂交则需50 50 IxgIxg； 另外，这种方法的重现性好，在相同条件下重另外，这种方法的重现性好，在相同条件下重复率可达复率可达90909595 ，大大提高了试验结果的可，大大提高了试验结果的可靠性。靠性。 2 缺点缺点 扩增片段短、假阳性高、检测扩增片段短、假阳性高、检测全部全部mRNAmR
7、NA工作量大、基因的克工作量大、基因的克隆受隆受mRNAmRNA表达的时效性影响等。表达的时效性影响等。而最大的问题还是而最大的问题还是假阳性太高假阳性太高。据研究，假阳性高达据研究，假阳性高达70%70% 所谓所谓假阳性假阳性指克隆的指克隆的DNADNA片段用片段用NorthernNorthern杂交时，没有阳性信杂交时，没有阳性信号号 3 DD-PCR3 DD-PCR中的主要问题及解决办法中的主要问题及解决办法内部因素：试剂、酶的质量，引物的类型和纯度，RNA的完整性、浓度和纯度等 外部因素：试验设计、适当的内部控制、回收带的标准、反应体系的建立、PCR管的类型及研究者操作的熟练程度等。
8、产产生生假假阳阳性性的的原原因因分分析析3.23.2改进改进DD-PCRDD-PCR方法方法 (1)(1)用用无无RNARNA酶的酶的DNADNA酶酶处理总处理总RNARNA，防止，防止DNADNA污染。污染。(2)(2)使用使用TagTag酶时，酶时，批号应相同批号应相同，不要经常，不要经常调换。调换。(3)PCR(3)PCR循环次数减至循环次数减至3030次，提高退火温度，次，提高退火温度，减少非特异性条带。减少非特异性条带。(4)(4)把从测序胶上切下来的条带纯化后分成把从测序胶上切下来的条带纯化后分成两部分，一部分用于克隆，另一部分用作探针两部分，一部分用于克隆，另一部分用作探针杂交以
9、筛选克隆。杂交以筛选克隆。(5)(5)改变引物长度，如有的在改变引物长度，如有的在33端锚定引端锚定引物和物和55端各加上端各加上1010个碱基，带上个碱基，带上EcoRIEcoRI双酶切双酶切位点，如此可显著提高重复性。位点，如此可显著提高重复性。3.4 克隆差异片段小的解决方法 差异显示得到的片段较小，不能代表真正差异差异显示得到的片段较小，不能代表真正差异表达的基因。为了得到全长的基因，表达的基因。为了得到全长的基因， 传统方法是采用传统方法是采用cDNAcDNA探针从探针从cDNAcDNA文库中筛选，文库中筛选，比较复杂。比较复杂。 目前目前, ,人们多采用人们多采用 LaurenLa
10、uren等创造的等创造的mRNA 5mRNA 5端端逐渐步移技术逐渐步移技术，以步移法获取的片段大小多在，以步移法获取的片段大小多在1 11.5kb1.5kb之间。之间。 另外还有一种叫另外还有一种叫RACE(cDNARACE(cDNA末端快速扩增末端快速扩增) )的方的方法法，也比较快速，简便。，也比较快速，简便。 4 4 引物的改进引物的改进 起初起初LiangLiang等设计的引物采用了等设计的引物采用了1212种种锚锚定寡聚脱氧嘧啶核苷酸引物定寡聚脱氧嘧啶核苷酸引物oligo(dT)12MNoligo(dT)12MN和和2020种不同的种不同的随机引物随机引物，缺点：不仅费时费力，由于
11、随机引物长缺点：不仅费时费力，由于随机引物长度短导致结果代表性差，而且得到的扩度短导致结果代表性差，而且得到的扩增片段也较小，所以差异条带易呈现假增片段也较小，所以差异条带易呈现假阳性结果阳性结果 。 ItoIto等将原本有两个固定碱基的等将原本有两个固定碱基的33端端锚定引物锚定引物变为只有一个固定碱基，使原来变为只有一个固定碱基，使原来l2l2种种引物减至引物减至3 3种种( (oligooligo dTdT 12A 12A，oligooligo dTdT 12C 12C，oligooligo dTdT 12G) 12G)， 优点优点：减少了每个：减少了每个mRNAmRNA样品对反转录反应
12、种类样品对反转录反应种类的需要，并且把由于简并性引起的某些的需要，并且把由于简并性引起的某些RNARNA代表性代表性差和差和RNARNA数量过多而引起数量过多而引起假阳性的现象降到最低程假阳性的现象降到最低程度度。 随后又有研究人员对随后又有研究人员对55端端引物进行了改进，随引物进行了改进，随机引物条数改为机引物条数改为8 8条，而且在两端引物上都带上了条，而且在两端引物上都带上了Hind Hind llIllI酶切位点，使得差异表达片段的克隆变酶切位点，使得差异表达片段的克隆变得更加简便得更加简便 5 mRNA差异显示技术在动物实验中的应用 栾新红等，利用改进后的银染栾新红等，利用改进后的
13、银染DDDDPCRPCR法筛选小鼠肝脏中差异表达的基因，法筛选小鼠肝脏中差异表达的基因，并进行鉴定，采用并进行鉴定，采用BLASTBLAST软件对阳性片段软件对阳性片段进行同源性分析。进行同源性分析。 结果：经反向结果：经反向Northern blotNorthern blot和测序鉴和测序鉴定后，获得了定后，获得了7 7条阳性差异表达基因片段条阳性差异表达基因片段(DD(DDESTsESTs) )，其中有，其中有2 2条条DDDDESTsESTs只在游只在游泳疲劳组表达，泳疲劳组表达，2 2条呈现下调表达，另条呈现下调表达，另3 3条条呈现上调表达呈现上调表达5 mRNA差异显示技术在动物实
14、验中的应用 孟元光等应用孟元光等应用mRNAmRNA差异显示技术，筛差异显示技术，筛选子宫内膜癌的相关基因片段。结果选子宫内膜癌的相关基因片段。结果 发现自定义的发现自定义的T1.7T1.7基因片段在于官内膜基因片段在于官内膜癌组织中呈癌组织中呈高表达高表达在增生的子宫内膜在增生的子宫内膜组织中呈组织中呈低表达低表达，在正常子宫内膜组织，在正常子宫内膜组织中中不表达不表达。因而得出结论。因而得出结论T1T17 7基因片基因片段可能是子宫内膜癌新的相关基因片段。段可能是子宫内膜癌新的相关基因片段。 5 mRNA差异显示技术在动物实验中的应用利用利用DDRTPCRDDRTPCR对不同生理状态或病理
15、过程中对不同生理状态或病理过程中基因表达进行分析，能揭示生理活动或病理基因表达进行分析，能揭示生理活动或病理过程的分子机制：过程的分子机制： LiLi等采用等采用DDRTPCRDDRTPCR技术，发现梅山猪甲状技术，发现梅山猪甲状腺激素腺激素亚基过量表达，分析推测认为，亚基过量表达，分析推测认为，亚基的过量表达亚基的过量表达很可能是梅山猪比白猪合成很可能是梅山猪比白猪合成系早达到性成熟的原因；严云勤等系早达到性成熟的原因；严云勤等 发现猪肾发现猪肾皮质中表皮生长因子皮质中表皮生长因子( (EGF)mRNAEGF)mRNA活性很高，而活性很高，而髓质中却无髓质中却无EGFmRNAEGFmRNA活
16、性。活性。 参考文献参考文献1 张小芳，金梅。张小芳，金梅。DDRT-PCR技术研究进展技术研究进展J.安徽农学通报安徽农学通报, 29-30 2 王秀利王秀利 ，李长绿，李长绿 ，刘，刘 娣娣.mRNA差异显示技术的研究差异显示技术的研究J.黑龙江畜牧兽医黑龙江畜牧兽医,2007年第年第 11期期;18-203 吴敏生吴敏生,王守才王守才,戴景瑞戴景瑞.差异显示技术差异显示技术(DD-PCR)及其应用及其应用J植物生理学通讯植物生理学通讯1999年年 第第35卷卷 第第4期期4 金金 谷，罗光彬谷，罗光彬,陶金程陶金程,牛京京牛京京.mRNA差异显示技术概述差异显示技术概述J . 饲料博览饲
17、料博览技术版技术版,2010,第第7期期, 14-17 5 王秀利王秀利,李长绿李长绿,刘刘 娣娣.mRNA差异显示技术的研究差异显示技术的研究J.黑龙江畜牧兽医黑龙江畜牧兽医,2007年年,第第1 1期期 18-206 吴敏生吴敏生,王守才王守才,戴景瑞戴景瑞.差异显示技术差异显示技术(DD-PCR)及其应用及其应用J.植物生理学通讯植物生理学通讯,1999,第第35卷卷,第第4期期7 金金 谷，罗光彬谷，罗光彬 ，陶金程，牛京京，陶金程，牛京京.mRNA差异显示技市概述差异显示技市概述J. 饲料博览饲料博览技术技术版版.2010年年,第第7期期14-178 蒋单懿蒋单懿.mRNA差异显示技
18、术的研究进展差异显示技术的研究进展J.江苏教育学院学报江苏教育学院学报(自然科学版自然科学版) 2006,9,第第23卷卷,第第3期期,41-449 栾新红，胡仲明，刘维全，江禹，柳巨雄，王凯栾新红，胡仲明，刘维全，江禹，柳巨雄，王凯.银染银染DD-PCR法筛选游泳疲劳小法筛选游泳疲劳小 鼠肝脏中差异表达基因的初步研究鼠肝脏中差异表达基因的初步研究J.中国应用生理学杂志中国应用生理学杂志 .296-29810 孟元光孟元光,魏丽惠魏丽惠,李春海等李春海等.应用应用mRNA差异显示技术筛选子宫内膜癌相关基因片段差异显示技术筛选子宫内膜癌相关基因片段J.中华妇产科杂志中华妇产科杂志 ,2001,6,第第36卷卷,第第6期期; 364-36811严云勤，张黎霞，谭景和严云勤，张黎霞，谭景和.猪肾脏中表皮生长因子猪肾脏中表皮生长因子mRNA活性的研究活性的研究J 解剖学解剖学 报报1999，30(2)：176177
