微生物酶活性试验方法

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1、微生物酶活性试验方法微生物酶活性试验方法脱氢酶活性脱氢酶活性测定方法参考： 【周春生, 尹军. 一 脱氢酶活性检测方法的研究 J. 环境科学学报 , 1996, 4:400-405.】以及【环境工程微生物检验手册M. 中国环境科学出版社, 1990.】（一）试验方法：（一）试验方法：（1 1）水样预处理：）水样预处理：取污泥混合液 10ml，放入离心管中离心5min 后去除上清液，用纯水反复清洗三次，最后向样品中加入纯水至 10ml 搅拌均匀。（2 2）加试剂：）加试剂：将处理后样品转移至 25ml 比色管中，依次加入缓冲液（PH=） 、硫酸钠溶液（%） 、纯水以及溶液（%） 、混匀。（3 3

2、）样品培养：）样品培养：将比色管置于 37条件下水浴恒温振荡器中培养，培养 5min后吸取 5ml 于离心管内，加甲醛固定以作样品空白；（4 4）终止酶反应：）终止酶反应：继续培养 30min，然后向管中加入 2ml 甲醛终止酶反应；（5 5）样品萃取：样品萃取：将样品培养液以为1份分装在四个离心管中，连同样品空白对照管一道离心5min, 弃去上清液向各离心管内加6ml丙酮, 研磨搅拌混合, 于37条件下萃取TF10min后；（6 6）比色分析：）比色分析：将萃取液进行离心5min,用1cm的比色皿取上清液显色液, 于波长485nm处进行比色, 记录吸光值,根据样品显色液与样品空白的吸光值之差

3、,查标准曲线, 进而计算出TF的生成速度, 即脱氢酶活性(mg/(L*h)（二）试剂：（二）试剂：（1 1）三苯基四氮唑氯化物溶液（氯化三苯基四氮唑，）三苯基四氮唑氯化物溶液（氯化三苯基四氮唑，TTCTTC）: :4g-2、3、5-氯化三苯基四氮唑，稀释至 1L 至容量瓶中，棕色瓶保存；（2 2）Tris-HClTris-HCl 缓冲液：缓冲液：称取（三羟甲基氨基甲烷, 分析纯, 北京化学试剂厂） ，加入 20ml 1mol/L HCl 溶液, 再定容至 1L；（3 3）硫酸钠溶液（）硫酸钠溶液（% %） ：硫酸钠（Na2SO3）稀释至1L容量瓶中；（4 4） TTCTTC标准溶液：标准溶液：

4、 称取定容与50ml茶色容量瓶茶色容量瓶中此溶液即为1mg/L的标准溶液。（三）标准曲线的绘制：（三）标准曲线的绘制：（1 1）采用1mg/L的TTC标准溶液制备每含20、40、60、80、100、120、140gTTC系列溶液，即取1、2、3、4、5、6、7ml至50ml容量瓶中，稀释至50ml进行实验；（2 2）用8试管，分别加入2ml Tris-HCl缓冲液、2ml纯水、2ml不同浓度的TTC，第八只不加入TTC；（3 3）加入10g硫酸钠溶液，TTC被还原为红色的TF；（4 4）加入5ml5ml丙酮丙酮振荡摇匀提取TF（振荡床振荡10次） ；（5 5）离心5min后485nm下测吸光度

5、；（6 6）吸光度为纵坐标，TTC浓度为横坐标绘制标准曲线。（四）计算：（四）计算：TF=A*B*CA：标准曲线上读数；B：计算时间矫正值：培养时间/60min；C 分光时的稀释倍数，当分光0,8 时，稀释分光ATPATP含量含量测定方法参考：【环境工程微生物检验手册M. 中国环境科学出版社, 1990.】ATP 消化后变为无机磷，制备 ATP消化液，测无机磷吸光度以确定 ATP含量（一）试验方法：（一）试验方法：（1 1）活性污泥稀释 1:20，曝气池稀释 1:10（保证 ATP量在之间） ；（2 2）用 50ml 烧杯加入 35ml 的（pH=Tris缓冲液）加热至沸腾；然后加入待测活性污

6、泥溶液 1ml， 煮沸加热 30-60s 后摇动几分钟放入冰浴中， 冷却后加入 的Tris 缓冲液至 50ml，摇匀过滤，所得过滤液供测 ATP；（3 3）ATPATP制备液消化：制备液消化：去待测液1ml于比色管中，加入硫酸，至于高压锅中加压128,15min，冷却后加入1-2滴过氧化氢，摇匀，纯水稀释，制成消化液；（4 4）取两支试管，加入消化液3ml，摇匀，另一只加入纯水3ml，各加入定磷试剂3ml，至于45水浴加热25min，冷却至室温，660nm下分光；（5 5）用上述曲线的吸光度在无机磷标准曲线上查出相应的无机磷含量，利用无机磷含量查Pi-ATP相关曲线，得出ATP值；ATPATP

7、含量高的污泥，微生物活性越高。含量高的污泥，微生物活性越高。（二）试剂：（二）试剂：（1 1）无机磷溶液中间液：）无机磷溶液中间液：烘干后称取 KH2PO4稀释至 500ml 容量品；（2 2）无机磷溶液使用液：）无机磷溶液使用液：上述溶液取 10ml 稀释至 100ml；（3 3）定磷试剂：定磷试剂：6mol/L 硫酸：水：%钼酸铵：10%抗坏血酸（体积比）=1：2:1:1，配置时按上述顺序加入试剂。溶液配制后当天使用，正常为浅黄绿色，若颜色不正常，则不能使用6mol/L 硫酸：取17ml 浓硫酸加入 83ml 水中，得6mol/L；%钼酸铵：钼酸铵100ml 容量瓶； 10%抗坏血酸： 取

8、 10g 抗坏血酸100ml 容量瓶 （棕色瓶冷藏） 。（4 4）ATPATP：10mgATP10mgATP（5 5） 的的 TrisTris 缓冲液：缓冲液： 稀释至 500ml+35ml 1mol/L 盐酸1000ml 容量瓶（6 6）10N10N 硫酸：硫酸：浓硫酸加入 700ml 纯水中，冷却后，稀释至 1000ml 容量瓶中；（三）标准曲线的（三）标准曲线的绘制：绘制：1、无机磷标准曲线的绘制（1 1）取KH2PO4置于烘箱中恒重后称取，稀释至500ml容量瓶中，得无机磷浓度100ug/L；（2 2）取10ml上述溶液稀释至100ml容量瓶中定容，得无机磷浓度10ug/L，取6之试管

9、；试管试管无机磷无机磷纯水纯水无机磷浓度无机磷浓度加定磷试剂加定磷试剂1 103032 2233 3434 4635 5836 6103（3 3）将试管置于45中水浴，保温25min，冷却后660nm下比色；（4 4）以吸光度作为纵坐标，无机磷含量为横坐标，绘制标准曲线；2 2、ATP-ATP-无机磷曲线绘制；无机磷曲线绘制；（1 1）称取10mgATP，取少量新配的的Tris缓冲液，充分摇匀溶解，定容至1L,最终浓度为10mg/L；取上清液，配置从系列标准液；（2 2）ATP标准液的消化：去待测液1ml于比色管中，加入硫酸，至于高压锅中加压128,15min，冷却后加入1-2滴过氧化氢，摇匀

10、，纯水稀释，制成消化液；（3 3）取两支试管，加入消化液3ml，摇匀，另一只加入纯水3ml，各加入定磷试剂3ml，至于45水浴加热25min，冷却至室温，660nm下分光；（4 4）以吸光度为纵坐标，ATP浓度为横坐标，绘制曲线；（5 5）用上述曲线的吸光度在无机磷标准曲线上查出相应的无机磷含量，然后作为纵坐标，ATP为横坐标，绘制Pi-ATP相关曲线。脲酶活性脲酶活性测定方法参考： 【李振高, 骆永明, 滕应. 土壤与环境微生物研究法M. 科学出版社, 2008.】根据脲酶水解时生成的氨与苯酚钠及次氯酸钠反应，形成兰色靛酚这一原理。（一）试验方法：（一）试验方法：（1 1）水样预处理：）水样

11、预处理：取 10ml 待测样品经甲苯处理后，加 510 滴甲苯，盖好；（2 2）加试剂：）加试剂：15min 后加 10ml 10%尿素和 20ml pH=柠檬酸盐缓冲液（3 3）样品培养：）样品培养：将锥形瓶置于 37条件下恒温箱，培养 24h 过滤；（4 4）继续加试剂：继续加试剂：取滤液 1-3mg/L（视样品浓度定） 与 50ml 比色管中， 加入 4ml苯酚钠溶液和 3ml 次氯酸钠溶液，边加边摇匀；（5 5）比色分析：）比色分析：20min后定容，并在578nm波长下分光；（6 6）计算：）计算：并在标准曲线上求氨氮的量，测出脲酶活性。每一土样设置用水代替基质（即尿素）的对照，以除

12、掉土壤中氨态氮引起的误每一土样设置用水代替基质（即尿素）的对照，以除掉土壤中氨态氮引起的误差差。还需减去无土基质（尿素柠檬酸盐） 。（二）试剂：（二）试剂：（1 1）甲苯（分析纯）甲苯（分析纯） ；（2 2）10%尿素：尿素（分析纯）10 克溶于 100 毫升蒸馏水中， （现配现用现配现用） ；（3 3）柠檬酸盐缓冲液：368克柠檬酸（分析纯）溶于600毫升蒸馏水中；295克氢氧化钾溶于水；将二种溶液合并，调pH至，并用水稀释至2L；（4 4）苯酚钠溶液：A A液液：苯酚溶于少量 95%乙醇，加 2 毫升甲醇和毫升丙酮，用乙醇稀释至 100 毫升。B B液液.27 克氢氧化钠溶于 100 毫升

13、水中。将二溶液保存在冰箱里。使用前，将溶液 A、B 各吸取 20 毫升混合，用蒸馏水稀释至 100 毫升；（5 5）次氯酸钠溶液：用蒸馏水稀释试剂，至活性氯浓度为%。 （次氯酸钠活性氯浓度为%） 。（6 6）标准溶液：）标准溶液：称 0.4717 克硫酸铵（105烘干）溶于水，稀释至 1 升（1 毫升含 100 微克氮）即 100ppm。（三）标准曲线的绘制：（三）标准曲线的绘制：（1）将 100ppm 的标准溶液稀释为 10ppm，分别吸取、 、 、 、 、 、 、于 50 毫升容量瓶或刻度试管中，加蒸馏水至 20ml；（2）再加 4ml 苯酚钠溶液和 3ml 次氯酸钠溶液，边加边摇匀，20

14、min 后显色，定容，使溶液浓度为： 、 、 、 、 、 、 、 。（3）1h 内在分光光度计上与波长 578nm 处比色，绘制标准曲线。（四）计算：（四）计算：脲酶活性以 24h 内每克土中氨态氮的毫克数来表示。NH3-N（mg/1g土 24h）=（土样浓度稀释倍数比色体积）（1000干土重）1000：1000 为 ug 换算成 mg土样浓度：标准曲线查得浓度硝酸还原酶活性硝酸还原酶活性测定方法参考： 【李振高, 骆永明, 滕应. 土壤与环境微生物研究法M. 科学出版社, 2008.】原理： 在厌氧条件下，通过样品与酚二磺酸的显色反应计算出反应前后硝态氮的含量差值，从而计算出硝酸还原酶的活性

15、。（一）试验方法：（一）试验方法：取 10ml 待测样品与 50ml 三角瓶中，加入葡萄糖，硝酸钾溶液，在真空下培养24h 后，利用酚二磺酸分光光度计测定反应前后硝酸盐的含量差值，最后计算出硝酸还原酶活性（二）试剂：（二）试剂：亚硝酸还原酶活性亚硝酸还原酶活性测定方法参考： 【李振高, 骆永明, 滕应. 土壤与环境微生物研究法M. 科学出版社, 2008.】原理： 通过亚硝态氮与格里试剂反应所产生的颜色深度，测定酶促反应前后亚硝态氮的变化，从而得出亚硝酸还原酶的活性。（一）试验方法：（一）试验方法：取 50ml 待测样品与 50ml 三角瓶中，加入葡萄糖，亚硝酸钠溶液，在真空下培养24h 后，

16、加入格里试剂显色，最后再波长 550nm 处测定反应前后的样品吸光度值，其差值可表示亚硝酸还原酶活性硝化速率的测定方法硝化速率的测定方法硝化强度的试验方法硝化强度的试验方法（一）试验方法：（一）试验方法：（1 1）150ml 三角瓶中盛 30ml 硝酸细菌培养基，灭菌；（2 2）培养：）培养：冷却，接种 1ml 活性污泥溶液，于 28培养 15 天，取出过滤。滤液装于塑料瓶中，低温保存（4 度以下，最好马上测下步） 。用比色法测定虑液中的亚硝酸含量。（3 3）加试剂：）加试剂：取滤液 1ml（取决于虑液中亚硝酸量）于 50ml 容量瓶中，定容。再取 1ml 定溶液于 50ml 比色管中， 稀释

17、至约 40ml， 加入 1ml 对氨基本磺酸试剂，放置 10 分钟，然后加入 1ml 萘胺试剂、1ml20醋酸钠，定容，呈色 10 分钟后，用分光光度计（波长 520nm）比色测定。 （潮土亚硝酸含量较少，可在第一步就就加显色剂，定容测定。 ）（4 4）标准曲线的绘制：）标准曲线的绘制：同时吸取亚硝酸根溶液（每毫升含毫克） 、1、2、3、4、5ml，分别放入50ml 比色管中，即得、 、 、 、 、亚硝酸根，与待测标本同样条件进行比色，根据标准系列得透光度绘制标准曲线，查出待测标本中亚硝酸根毫克数。（5 5）与此同时，用同一方法测定原始培养液中亚硝酸根含量（二）试剂：（二）试剂：（1 1）硝酸

18、细菌培养基：）硝酸细菌培养基： NaNO2克MgSO47 H2O0.03 克K2HPO40.75 克MnSO44 H2O0.01 克NaH2PO40.25 克蒸馏水1000 毫升Na2CO31.0 克（2）格利斯氏试剂：格利斯氏试剂：（a）对氨基苯磺酸试剂：对氨基苯磺酸试剂：溶解对氨基苯磺酸于 70ml 沸蒸馏水中，冷却后加入20ml 浓盐酸，然后稀释成 100ml，贮于棕色瓶棕色瓶中，保存于冷处备用冷处备用。（b） 萘胺试剂：萘胺试剂： 溶解萘胺于含1ml 浓盐酸的蒸馏水中， 然后稀释至 100ml，贮于棕色瓶棕色瓶中，保存于冷处备用。（3）20醋酸钠（三）标准曲线的绘制：（三）标准曲线的绘制：亚硝酸根标准溶液：亚硝酸根标准溶液： 称取分析纯亚硝酸钠于烧杯中，加蒸馏水溶解后洗入1000ml 量瓶中，再加蒸馏水至刻度，摇匀。此溶液中亚硝酸根浓度为 1000ppm（即 1ml 含亚硝酸根 1mg） 。 用时以此液配成稀的亚硝酸根标准溶液 （每毫升含） 。（四）计算：（四）计算：（1 1）NO-2N 毫克数/30 毫升活性污泥ppm比色体积稀释倍数10-3式中 ppm由标准曲线查知；10-3换算为毫克。（2 2）根据下式计算活性污泥硝化作用强度：硝化作用原始培养基中 NO-2量-培养后培养基中 NO-2量100/原始培养基中 NO-2量原始培养基中 NO-2量：1g/L