《蛋白质的结构与功能教学ppt课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质的结构与功能教学ppt课件（69页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第一章第一章 蛋白质的构造与功能蛋白质的构造与功能Chapter 1 Structure and Function of Proteins n生物体内的蛋白质含量生物体内的蛋白质含量 n 除水以外，机体组织中最多的是除水以外，机体组织中最多的是蛋白质，占人体干重的蛋白质，占人体干重的45%n蛋白质功能非常复杂，机体任何功能均蛋白质功能非常复杂，机体任何功能均与蛋白质有直接关系，大体可以分为：与蛋白质有直接关系，大体可以分为：构造，运动，运输，防御，催化，信息构造，运动，运输，防御，催化，信息等。等。第一节第一节 蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成元素：C、H、O、N、S，特点是含N 13-19%
2、 ， 平均16%蛋白质中氮的含量比较恒定，平均为16%，故可以用定氮法丈量蛋白质含量每克氮相当于6.25克蛋白质一一 氨基酸氨基酸 Amino Acid自然界组成蛋白质的氨基酸有自然界组成蛋白质的氨基酸有20种，都属于种，都属于L- -氨基酸氨基酸D系氨基酸也有，构成自然界小分系氨基酸也有，构成自然界小分子，而不构成蛋白质大分子子，而不构成蛋白质大分子通式为通式为 也可写为也可写为HaOHCRNHO2CHaOCRNHOC3+_氨基酸氨基酸 Amino Acid 2n氨基氨基(NH2-)和和羧基基(-COOH)同共同共连于于 -碳原子上。碳原子上。n其中其中19种种为L-氨基酸氨基酸(除甘氨酸外
3、除甘氨酸外)，另外，脯氨基酸另外，脯氨基酸为亚氨基酸，不氨基酸，不过普通普通统称氨基酸称氨基酸n由于由于组成蛋白成蛋白质的氨基酸是不完好的，的氨基酸是不完好的，所以称所以称为氨酸酸残基氨酸酸残基一氨基酸的分类一氨基酸的分类 n20种氨基酸，依其种氨基酸，依其R侧链可以分为以下侧链可以分为以下4种：种：n非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸 7种：侧链为烃基或种：侧链为烃基或氢氢 甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸n极性中性氨酸酸极性中性氨酸酸 8种：侧链含有杂环、羟种：侧链含有杂环、羟基、酰胺基、巯基等基、酰胺基
4、、巯基等 色氨酸、丝氨酸、酪氨色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸苏氨酸氨基酸的分类氨基酸的分类 2n酸性氨酸酸性氨酸2种：侧链含有羧基种：侧链含有羧基 天冬天冬氨酸、谷氨酸氨酸、谷氨酸n碱性氨基酸碱性氨基酸3种：侧链含有氨基、胍种：侧链含有氨基、胍基或咪唑基基或咪唑基 赖氨酸、精氨酸、组氨酸赖氨酸、精氨酸、组氨酸n在蛋白质中，脯氨酸可被修饰为羟脯氨在蛋白质中，脯氨酸可被修饰为羟脯氨酸、两个半胱氨酸的巯基可脱氢构成二酸、两个半胱氨酸的巯基可脱氢构成二硫键，称为胱氨酸硫键，称为胱氨酸二氨基酸的理化性质二氨基酸的理化性质n1
5、 两性电离与等电点两性电离与等电点n氨基酸的氨基和羧基具有一定碱性和酸性，在氨基酸的氨基和羧基具有一定碱性和酸性，在酸性环境下，氨基可以接受酸性环境下，氨基可以接受H+生成生成+H3N-，在碱性环境下，羧基可以游离在碱性环境下，羧基可以游离H+ 生成生成-COO-，因此氨基酸是两性电解质。在某一，因此氨基酸是两性电解质。在某一pH的溶的溶液中，氨基酸离解成阳离子和阴离子的趋势相液中，氨基酸离解成阳离子和阴离子的趋势相等，成为兼性离子，对外呈电中性，此时该溶等，成为兼性离子，对外呈电中性，此时该溶液的液的pH值称为此氨基酸的等电点值称为此氨基酸的等电点pI氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质 2n2
6、 紫外吸收性质紫外吸收性质: 色氨酸、酪氨酸的最大吸收色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在峰在280nm波长附近，由于大多数蛋白质都波长附近，由于大多数蛋白质都含有此二种氨基酸，所以可以利用此性质快速含有此二种氨基酸，所以可以利用此性质快速测定蛋白质。测定蛋白质。n3 茚三酮反响茚三酮反响: 氨基酸与茚三酮水合物共热，氨基酸与茚三酮水合物共热，茚三酮水合被复原，后者再与氨基酸分解出的茚三酮水合被复原，后者再与氨基酸分解出的氨反响，生成蓝色化合物，可在氨反响，生成蓝色化合物，可在570nm波优波优点测定，用于氨基酸的定量点测定，用于氨基酸的定量二、二、 肽肽 peptiden(一一) 肽(peptide
7、)n1 肽键：一个氨基酸的：一个氨基酸的-COOH 和另一个和另一个氨基酸的氨基酸的-NH2脱水构成脱水构成肽键，化学上普，化学上普通称通称为酰胺胺键(p10)n2 氨基酸之氨基酸之间借借肽键衔接起来叫接起来叫肽，由，由两个氨基酸残基两个氨基酸残基组成的成的肽称二称二肽，由三，由三个氨基酸残基个氨基酸残基组成的成的肽称三称三肽， 肽 peptiden由多个氨基酸残基组成的肽叫多肽由多个氨基酸残基组成的肽叫多肽n蛋白质是由多个氨基酸残基组成的肽，蛋白质是由多个氨基酸残基组成的肽，因此，称为多肽，有时也称多肽链因此，称为多肽，有时也称多肽链n寡肽：氨基酸残基数不大于寡肽：氨基酸残基数不大于10的肽
8、链。的肽链。一生物活性肽一生物活性肽n人体内有人体内有许多具有特殊作用的多具有特殊作用的肽，在神，在神经传导、代、代谢调理、理、维护机体功能等方机体功能等方面有重要作用，面有重要作用，统称称为活性活性肽，常，常见的的有：有：n1 谷胱甘谷胱甘肽GSH 是由谷氨酸、半胱是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸氨酸、甘氨酸组成的三成的三肽。n其构造上的特点是：第一个其构造上的特点是：第一个肽键由谷氨由谷氨酸的酸的羧基与半胱氨酸的氨基基与半胱氨酸的氨基组成成生物活性肽生物活性肽 2n生理活性：谷胱甘肽分子中半胱氨酸上生理活性：谷胱甘肽分子中半胱氨酸上的巯基具有复原性，是体内重要的复原的巯基具有复原性，是体内重要
9、的复原剂，维护体内蛋白质、酶分子中的巯基剂，维护体内蛋白质、酶分子中的巯基不被氧化；在谷胱甘肽过氧化物酶的催不被氧化；在谷胱甘肽过氧化物酶的催化下，化下，GSH复原细胞内产生的复原细胞内产生的H2O2；阻断外源嗜电子毒物，维护阻断外源嗜电子毒物，维护DNA、RNA。n 生物活性肽生物活性肽 3n2 多多肽类激素及神激素及神经肽n激素激素肽类：多：多为促激素促激素类 如催如催产素素9肽、加加压素素9肽促促肾上腺皮上腺皮质激素激素39肽、促甲状腺素促甲状腺素释放激素焦谷氨放激素焦谷氨酰组氨氨酰脯氨酸脯氨酸 3肽n神神经肽：有信号：有信号转导作用作用 如如脑啡啡肽5肽、-内啡内啡肽31肽、强啡啡肽1
10、7肽、P物物质10肽、神、神经肽Y等等三三 蛋白质的分类蛋白质的分类n1 依分子外形分：球状蛋白质和纤维状依分子外形分：球状蛋白质和纤维状蛋白质蛋白质n球状蛋白质，外形为球形或椭圆形，多球状蛋白质，外形为球形或椭圆形，多数可溶于水，如酶、转运蛋白、抗体等数可溶于水，如酶、转运蛋白、抗体等n纤维状蛋白质，分子长轴比短轴长纤维状蛋白质，分子长轴比短轴长10倍倍以上，多为构造蛋白质，较难溶于水，以上，多为构造蛋白质，较难溶于水，作为细胞的支架作为细胞的支架蛋白质的分类蛋白质的分类n2 依组成分：单纯蛋白质和结合蛋白质依组成分：单纯蛋白质和结合蛋白质n单纯蛋白质，只由氨基酸残基组成，即单纯蛋白质，只由
11、氨基酸残基组成，即只由肽链组成。只由肽链组成。n结合蛋白质，蛋白质部分结合蛋白质，蛋白质部分+非蛋白质部分，非蛋白质部分，蛋白质部分为肽链，非蛋白质分部称为蛋白质部分为肽链，非蛋白质分部称为辅基。辅基是蛋白质功能不可或缺的重辅基。辅基是蛋白质功能不可或缺的重要组分。常见的有色素、寡糖、脂类、要组分。常见的有色素、寡糖、脂类、磷酸、金属离子，核酸等磷酸、金属离子，核酸等第二节第二节 蛋白质的分子构造蛋白质的分子构造n体内有生理活性的蛋白质有着特定的构造，体内有生理活性的蛋白质有着特定的构造，这种特定构造的改动，就会使其活性遭到影这种特定构造的改动，就会使其活性遭到影响，甚至失去活性。响，甚至失去
12、活性。n这种特定构造包含两方面的意义：这种特定构造包含两方面的意义：n 1 组成肽链的氨基酸的种类和顺序；组成肽链的氨基酸的种类和顺序；n 2 肽链中各残基及其侧链在空间的相对位肽链中各残基及其侧链在空间的相对位置。前者称为蛋白质的一级构造，后者称为置。前者称为蛋白质的一级构造，后者称为蛋白质的空间构造，空间构造包括二、三、蛋白质的空间构造，空间构造包括二、三、四级构造四级构造一一 蛋白质的一级构造蛋白质的一级构造n蛋白质的一级构造是指在多肽链中氨基蛋白质的一级构造是指在多肽链中氨基酸残基的陈列顺序，以及它们之间的衔酸残基的陈列顺序，以及它们之间的衔接方式接方式n化学键：共价键衔接化学键：共价
13、键衔接n 主键是肽键，其次是二硫键主键是肽键，其次是二硫键n 蛋白质的一级构造蛋白质的一级构造n肽链一级构造的写法有一定要求：肽链一级构造的写法有一定要求： N端端或称氨基末端位于左侧，或称氨基末端位于左侧，C端或称羧基末端或称羧基末端位于右侧，氨基酸残基的顺序从左到端位于右侧，氨基酸残基的顺序从左到右顺序陈列右顺序陈列n一级构造是蛋白质空间构象和特异生物一级构造是蛋白质空间构象和特异生物学功能的根底，但一级构造并不是决议学功能的根底，但一级构造并不是决议蛋白质空间构象的独一要素蛋白质空间构象的独一要素二二 蛋白质的二级构造蛋白质的二级构造n是指蛋白质分子中某一肽段肽链的部分是指蛋白质分子中某
14、一肽段肽链的部分空间构造，也就是该肽段主链骨架原子空间构造，也就是该肽段主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象侧链的构象n空间构造的研讨方法空间构造的研讨方法 ：X射线晶体衍射射线晶体衍射法法X-ray diffraction蛋白质的二级构造蛋白质的二级构造 n参与参与肽键的的6个原子个原子组成的平面叫成的平面叫肽单元元包括：包括： C1，C，O，N，H，C2n肽单元元peptide unit 特征：特征：n 1 参与参与肽键的的6个原子位于同一平面个原子位于同一平面n 2 肽键有部分双有部分双键性性质不能自在旋不能自在旋转n 3 C1与与C
15、2为反式构造，其上反式构造，其上衔接的接的两个两个单键可自在旋可自在旋转蛋白质二级构造蛋白质二级构造 n二二级构造的方式：构造的方式：n-螺旋螺旋-Helixn-折叠折叠 -pleated sheetsn-转角角 -bend orturnn无无规卷曲卷曲random coil)-螺旋螺旋 -Helix n蛋白蛋白质分子分子肽链中的某些段落，可中的某些段落，可以沿着其的以沿着其的长轴，以右手螺旋方式，以右手螺旋方式进展反复、展反复、规律、周期性的律、周期性的陈列。列。-角蛋白中角蛋白中肽链螺旋构培育是螺旋构培育是这样，故称故称为-螺旋螺旋n特点：特点：n1右手螺旋右手螺旋 n2每每3.6个氨基酸
16、上升一圈个氨基酸上升一圈 n3螺距为螺距为0.54nm n4肽键的肽键的N-H与第与第4个肽键的羰基氧构个肽键的羰基氧构成氢键，氢键与螺旋长轴根本平行成氢键，氢键与螺旋长轴根本平行-折叠折叠 -pleated sheets n肽链沿长轴充分伸展，整个肽链构成一肽链沿长轴充分伸展，整个肽链构成一个锯齿状构造，几条肽链彼此平行，靠个锯齿状构造，几条肽链彼此平行，靠H键维系固定，就构成了片层构造键维系固定，就构成了片层构造n特点：折纸状，平行或反平行陈列特点：折纸状，平行或反平行陈列n -转转角角 -bend orturn n在球状蛋白在球状蛋白质分子中，分子中，肽链经常会出常会出现180o回折，回
17、折部分即成回折，回折部分即成为-转角角n特点：特点：4残基残基组成，第一个残基的成，第一个残基的羰基氧基氧与第四个残基的氨基与第四个残基的氨基氢构成构成氢键，第二，第二个残基常个残基常为脯氨酸脯氨酸n无无规卷曲卷曲random coil) 无确定无确定规律律的的肽链构造构造模体与分子伴侣模体与分子伴侣n模序：蛋白模序：蛋白质分子二个或三个具有二分子二个或三个具有二级构造的构造的肽段，在空段，在空间上相互接近，构成具有特殊功能上相互接近，构成具有特殊功能的空的空间构造被称构造被称为模序模序motif。有三种方。有三种方式：式： -螺旋螺旋组合合 、 -折叠折叠组合合 、-螺旋螺旋-折叠折叠组合合
18、 。不同模序。不同模序有不同的构造和功能，有不同的构造和功能，P15n分子伴分子伴侣chaperon：一：一类蛋白蛋白质分子，分子，可逆地与未折叠可逆地与未折叠肽链的疏水部分的疏水部分结合，合，诱导其其正确折叠和构成特有二硫正确折叠和构成特有二硫键 。三三 蛋白质的三级构造蛋白质的三级构造n指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，也就是整条肽链一切原子在三间位置，也就是整条肽链一切原子在三维空间的排布位置维空间的排布位置n三级构造的维持：疏水作用，离子键，三级构造的维持：疏水作用，离子键，氢键，范氏力等氢键，范氏力等蛋白质的三级构造蛋白质的三级构造 n域构造
19、域构造n在较大的蛋白质分子中，常可分割成折叠得较在较大的蛋白质分子中，常可分割成折叠得较为严密为严密,在空间上可以明显区别的在空间上可以明显区别的1个或数个球个或数个球状或纤维状区域状或纤维状区域构造域各有相对独立的功能。构造域各有相对独立的功能。如纤连蛋白如纤连蛋白n三级构造构成后，生物学活性必需基团接近，三级构造构成后，生物学活性必需基团接近，构成活性中心或部位，即蛋白质分子外表构成构成活性中心或部位，即蛋白质分子外表构成了某些发扬生物学功能的特定区域。了某些发扬生物学功能的特定区域。四、蛋白质的四级构造四、蛋白质的四级构造n二个或二个以上具有独立的三级构造的多肽链，二个或二个以上具有独立
20、的三级构造的多肽链，彼此借次级键相连，成为一定的空间构造，称彼此借次级键相连，成为一定的空间构造，称为四级构造为四级构造n具有独立三级构造的多肽链，称为亚基或亚单具有独立三级构造的多肽链，称为亚基或亚单位位subunit，亚基可以一样，亦可以不同，亚基可以一样，亦可以不同n单独亚基，多无生物学功能，二个以上亚基聚单独亚基，多无生物学功能，二个以上亚基聚合成为有完好四级构造的蛋白质，才有功能，合成为有完好四级构造的蛋白质，才有功能，如血红蛋白如血红蛋白第三节第三节 蛋白质构造与功能的关系蛋白质构造与功能的关系n一、蛋白质一级构造与功能的关系一、蛋白质一级构造与功能的关系n(一一)级构造是空间构象
21、的根底级构造是空间构象的根底n Rnase是由是由124氨基酸残基组成的单氨基酸残基组成的单肽链，分子中肽链，分子中 8 个个Cys的的-SH构成构成4对二对二硫键，构成具有一定空间构象的蛋白质。硫键，构成具有一定空间构象的蛋白质。二一级构造与功能的关系二一级构造与功能的关系n一级构造相近，空间构造相近，功能相一级构造相近，空间构造相近，功能相近近n蛋白质一级构造的种属差别与分子进化蛋白质一级构造的种属差别与分子进化n对于不同种属来源的同种蛋白质进展一对于不同种属来源的同种蛋白质进展一级构造测定和比较，发现存在种属差别，级构造测定和比较，发现存在种属差别，这种差别能够是分子进化的结果但与活这种
22、差别能够是分子进化的结果但与活性和蛋白质空间构造亲密相关的氨基酸性和蛋白质空间构造亲密相关的氨基酸残基高度保守。残基高度保守。蛋白质的一级构造与分子病蛋白质的一级构造与分子病n 现知几乎一切遗传病都于蛋白质分子构造改动有关，都称之为分子病。n 镰刀型红细胞贫血是1944年首先被发现并称为分子病的。二、蛋白质的空间构造与功能的关系二、蛋白质的空间构造与功能的关系nHb结合氧：结合氧：n第一个第一个O2结合时，要翻开的盐键不只是结合时，要翻开的盐键不只是4个亚个亚基间盐键的基间盐键的1/4，而是要多一些，翻开盐键需，而是要多一些，翻开盐键需求能量。因此，第一个求能量。因此，第一个O2的结合需求的能
23、量的结合需求的能量多于第多于第2、第、第3个个O2 n结合到第结合到第4个个O2时，需能更少，带时，需能更少，带O2速度比速度比第第1个时大几百倍。个时大几百倍。nHb与与O2后后Hb的构象变化，这类变化称为变构的构象变化，这类变化称为变构效应，即经过构象变化影响蛋白质的功能效应，即经过构象变化影响蛋白质的功能nHb称为变构蛋白称为变构蛋白allosteric protein蛋白质的空间构造与功能的关系蛋白质的空间构造与功能的关系n构型构型configuration：L、D，改动，改动时有共价键的断裂时有共价键的断裂n构象构象conformation：改动无须有共：改动无须有共价键的断裂，只是
24、次级键断裂价键的断裂，只是次级键断裂n一级构造是蛋白质生物学功能的根底，一级构造是蛋白质生物学功能的根底，空间构造与功能的表现有关空间构造与功能的表现有关第四节第四节 蛋白质的理化性质及其分别纯化蛋白质的理化性质及其分别纯化等电点 PHPI Isoelectric Piont等电点的计算R为非极性基团 R为非游离基团 PI=1/2PK-COOH/PK1+PK-NH2/PK2R为极性基团 酸性氨基酸：PI=1/2PK-COOH+ PKR 碱性氨基酸：PI=1/2 PK-NH2 +PKRCys 按酸性氨基酸；Tyr 按R为非极性基团情况计算二蛋白质的胶体性质二蛋白质的胶体性质n胶体溶液：溶质颗粒直
25、径在胶体溶液：溶质颗粒直径在1-100nm的稳定的稳定溶液溶液n 易沉降易沉降n 粘度大粘度大n 不能透过半透膜不能透过半透膜n蛋白质胶体溶液的稳定要素：蛋白质胶体溶液的稳定要素：n 水化膜水化膜n 带电荷带电荷三蛋白质的沉淀作用三蛋白质的沉淀作用n使蛋白质从溶液中析出的景象称为沉淀，使蛋白质从溶液中析出的景象称为沉淀，方法有：方法有：n盐析盐析salting outn有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀n重金属盐沉淀重金属盐沉淀 条件：条件：pH 稍大于稍大于pI为宜为宜n生物碱试剂与某些酚类沉淀蛋白质生物碱试剂与某些酚类沉淀蛋白质 条条件：件：pH稍小于稍小于pI 四蛋白质的变性作用、结絮和凝固四蛋白
26、质的变性作用、结絮和凝固n在某些理化要素作用下，蛋白质严密的在某些理化要素作用下，蛋白质严密的空间构象破坏，导致假设干理化性质和空间构象破坏，导致假设干理化性质和生物学性质的改动生物学性质的改动n变性要素：变性要素：n1物理要素：高温、高压、射线等物理要素：高温、高压、射线等n2化学要素：强酸、强碱、重金属盐、化学要素：强酸、强碱、重金属盐、某些有机溶剂等某些有机溶剂等变性的表现和意义变性的表现和意义变性后的表现：变性后的表现：1生物学活性消逝生物学活性消逝2理化性质改动理化性质改动 如粘度增大，易沉淀，如粘度增大，易沉淀，结晶才干丧失等结晶才干丧失等变性的意义：变性的意义：1消毒、灭菌；防止
27、变性有利于蛋白质的消毒、灭菌；防止变性有利于蛋白质的保管保管2变性后易消化变性后易消化五蛋白质的颜色反响五蛋白质的颜色反响n蛋白质的颜色反响主要与蛋白质的定性、定量测定有关：n茚三酮反响n双缩脲反响n酚试剂反响六蛋白质的紫外吸收特征六蛋白质的紫外吸收特征n蛋白质溶液能吸收一定波长的紫外线，蛋白质溶液能吸收一定波长的紫外线，主要是由带芳香环的氨基酸决议的。其主要是由带芳香环的氨基酸决议的。其对紫外光吸收才干的强弱顺序为：色对紫外光吸收才干的强弱顺序为：色Trp酪酪Tyr苯丙苯丙n可利用此性质对蛋白质溶液进展快速测可利用此性质对蛋白质溶液进展快速测定，其特点是不破坏样品。定，其特点是不破坏样品。二
28、二 蛋白质的分别与纯化蛋白质的分别与纯化n一丙一丙酮沉淀及沉淀及盐析析n丙丙酮沉淀：沉淀：0-4，加，加10倍体倍体积的丙的丙酮，另外也可用乙醇沉淀另外也可用乙醇沉淀n盐析析salt precipitation：是将硫酸：是将硫酸铵、硫酸、硫酸钠、或、或氯化化钠等中性等中性盐参与蛋参与蛋白白质溶液，不同蛋白溶液，不同蛋白质可在不同可在不同盐浓度度和一定和一定pH时产生沉淀，此法可用于蛋白生沉淀，此法可用于蛋白质的初步分的初步分别二电泳二电泳n电泳的概念：带电离子受电场作用发生电泳的概念：带电离子受电场作用发生位移的景象位移的景象n原理：蛋白质分子在低于或高于其原理：蛋白质分子在低于或高于其pI
29、的的溶液中带有电荷，在电场中可向其电荷溶液中带有电荷，在电场中可向其电荷相反的电极挪动，用此法可分析和分别相反的电极挪动，用此法可分析和分别蛋白质蛋白质n电泳的载体：纸、薄膜等电泳的载体：纸、薄膜等三透析三透析dialysisn用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。透析袋是具有超小微孔物分开的方法。透析袋是具有超小微孔的膜，不同的膜有不同的孔径。微孔普的膜，不同的膜有不同的孔径。微孔普通只允许通只允许10000以下的化合物经过以下的化合物经过n四层析四层析chromatographyn层析种类：蛋白质分别纯化中常用的有离子层析种类：蛋白质分别纯化中常
30、用的有离子交换层析，亲和层析，肽段的分别纯化中也交换层析，亲和层析，肽段的分别纯化中也有用双向纸层析有用双向纸层析n五分子筛五分子筛gel filtration：也称凝胶：也称凝胶过滤。柱填料多用葡聚糖过滤。柱填料多用葡聚糖分子筛分子筛 用于分别的资料是充溢孔径的凝胶颗粒，小的分子可进入孔径内大分子无法进入，在洗脱过程中，大分子先流出，小分子由于路程较长而后流出，从而使蛋白质得以分别六超速离心六超速离心ultracentrifugationn蛋白质在高达蛋白质在高达50万万g 的重力作用下，在的重力作用下，在溶液中逐渐沉降，直到其浮力溶液中逐渐沉降，直到其浮力buoyant force与离心力
31、所产生的力与离心力所产生的力相等，此时蛋白质不再沉降，不同密度相等，此时蛋白质不再沉降，不同密度蛋白质的密度与外形不同，此时在离心蛋白质的密度与外形不同，此时在离心管不同位置可构成不同的蛋白质沉降带，管不同位置可构成不同的蛋白质沉降带，搜集不同带的成分，可到达分别纯化蛋搜集不同带的成分，可到达分别纯化蛋白质的目的。蛋白质在离心场中的行为白质的目的。蛋白质在离心场中的行为用沉降系数用沉降系数S表示表示三三 多肽链中氨基酸序列分析多肽链中氨基酸序列分析n1、 氨基酸氨基酸组成分析成分析n用于序列分析蛋白用于序列分析蛋白质，需是均一的，知大，需是均一的，知大约分分子量，然后将此很子量，然后将此很纯的
32、蛋白的蛋白质样品品彻底水解底水解n规范水解法：用范水解法：用6N HCl，于，于100-120下，下，在真空瓶中在真空瓶中进展。水解展。水解时间为10-24 hr。水解。水解后去除后去除过量的量的HCl，得到氨基酸混合物，然后，得到氨基酸混合物，然后用用层析或析或电泳法分析各种氨基酸的百分率，再泳法分析各种氨基酸的百分率，再根据分子量，可初步根据分子量，可初步计算出被算出被测蛋白蛋白质的氨基的氨基酸酸组成成多肽链中氨基酸序列分析多肽链中氨基酸序列分析n2、 N-末端分析和末端分析和C-末端分析末端分析n二硝基氟苯二硝基氟苯+-氨基氨基(-肽链)二硝基苯氨基酸二硝基苯氨基酸(黄色黄色)，再水解，
33、再水解肽链，层析分析分别并并鉴定二硝基定二硝基苯氨基酸苯氨基酸 目前多用丹目前多用丹酰氯(荧光光)替代二硝基替代二硝基苯。用两种或以上不同方法水解蛋白苯。用两种或以上不同方法水解蛋白质，因水解部位不同，可得到两系列不同的小因水解部位不同，可得到两系列不同的小肽段，段，再从两系列中找出关再从两系列中找出关键性的重叠的性的重叠的肽段，即可段，即可将将肽段段衔接得到蛋白接得到蛋白质序列序列多肽链中氨基酸序列分析多肽链中氨基酸序列分析n3 水解肽链成多个片段，分别分析水解肽链成多个片段，分别分析n水解肽链的方法有化学法和酶法，用双水解肽链的方法有化学法和酶法，用双向层析法分别肽段向层析法分别肽段P30n将每一肽段用将每一肽段用Edman法分析法分析四四 蛋白质空间构造的测定蛋白质空间构造的测定n空空间构造的研构造的研讨方法方法X射射线晶体衍射晶体衍射法法X-ray diffractionn 分析系分析系统组成：成：n X射射线源、蛋白源、蛋白质晶体、晶体、检测器器
