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1、荧光定量荧光定量PCR技术在技术在临床检测中的应用临床检测中的应用PCR与基因诊断技术基因诊断即通过核酸的分子生物学检测直接检测基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种DNA的快速扩增技术。PCR技术通过两个短的称为引物的DNA小片段和一种耐热酶的作用，可在3个小时内把特定的DNA片段扩增1000万倍。 九十年代中期PCR临床应用在国内全面开展，1998年，荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测。4 基因诊断3 免疫学诊断临床诊断细胞膜细胞核DNA转录 mRNA翻译蛋白质1 形态学诊断2 生化诊断概念基本
2、原理基本原理以以DNA为例为例（1 1）DNA变性变性：（2 2）降温退火：）降温退火：（3 3）引物延伸）引物延伸：原理原理 第一步第一步 加热变性加热变性预处理第二步第二步 引物与靶序列退火引物与靶序列退火第三步第三步 - - 引物延伸引物延伸第第1 1个个 PCR PCR 循环完成后循环完成后 得到两个拷贝的靶序列得到两个拷贝的靶序列PCRPCR.exe动画3030次循环后靶序列扩增的数次循环后靶序列扩增的数量量No. ofNo. Amplicon Cycles Copies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,824荧光荧光PC
3、R的原理的原理PCRPCR技术的特点技术的特点 灵敏灵敏度高度高 特异特异性强性强 快速快速简便简便 应用应用范围广范围广Ct值的意义Ct值与重复性值与重复性同一样本在相同条件下同时进行同一样本在相同条件下同时进行96次次扩增扩增FQ-PCRCt值与浓度值与浓度不同的模板达到荧光域值时的不同的模板达到荧光域值时的Ct值不同值不同感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断 母婴传播的控制与观察母婴传播的控制与观察 遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断 肿瘤的诊断肿瘤的诊断 法医学鉴定法医学鉴定荧光定量荧光定量PCR的临床应用的临床应用早期诊断早期诊断 病情评估和预后判断病情评估和预后判断 抗病毒药物疗效的观察、指
4、导抗病毒药物疗效的观察、指导 新药验证新药验证一 感染性疾病 1. 病原体含量与病情之间的关系 2. 病原体含量与用药之间的关系 3. 药物及疗法的研究与开发 4. 新的病原体分子诊断标准 5. 新的愈后指标 6. 传染病发病的监控、预测与预防临床应用临床应用二 肿瘤1. 肿瘤标志物：癌胚抗原、同功酶、抗体、激素、细胞因子、受体等2. 肿瘤相关基因表达的检测：包括癌基因抗癌基因、肿瘤转移基因及转移抑制基因三 遗传病1. 等位基因检测2. 多基因遗传病的突变检测3. 基因表达异常所致遗传病检测 1.亲子鉴定 2.法医物证 3.PCR-RFLP技术的法医学应用 4.罪犯鉴定法医鉴定法医鉴定免疫学诊
5、断主要是抗原抗体反应，应用于临免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产生抗体以后，而许多病原体床通常在体内产生抗体以后，而许多病原体的免疫学检测存在较长的的免疫学检测存在较长的“窗口期窗口期”，不利，不利于对疾病的早期诊断；于对疾病的早期诊断；PCRPCR方法直接检测病方法直接检测病原体的原体的DNA/RNADNA/RNA，能大大缩短，能大大缩短“窗口期窗口期”，其高灵敏度的检测显然也有利于疾病的早期其高灵敏度的检测显然也有利于疾病的早期诊断诊断。疾病的早期诊断疾病的早期诊断荧光定量PCR在病原体检测中的应用一 肝炎病毒定量检测二 性病病原体检测三 结核杆菌及呼吸道病原体检测四 优
6、生优育(TORCH)相关项目检测临床应用一肝炎病毒定量检测HBVHCV临床应用（一） 乙型肝炎病毒结构及特点HBsAg：是HBV感染的主要标志HBsAb：保护性抗体HBcAg：仅存于感染的肝细胞核内，一般不存在于血循环中HBcAb: 非保护性抗体，HBcAb-IgM提示HBV处于复制状态HBeAg：HBV复制及强感染性的指标HBeAb：有一定的保护作用，预后良好HBVHBV（二） HBV-DNA与“两对半”1. “1. “两对半两对半” ” ：机体的免疫反应状态；：机体的免疫反应状态；2. “2. “携带者携带者” ”、“ “大三阳大三阳” ”、“ “小三阳小三阳” ”等免疫学指标不能等免疫学
7、指标不能 反应体内病毒复制水平与感染程度。反应体内病毒复制水平与感染程度。FQ-PCRFQ-PCR：检测的是：检测的是HBVHBV本身的遗传物质本身的遗传物质DNADNA，是，是 病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。（二） HBV-DNA与“两对半”3. 血清学指标()不能排除HBV感染。 HBVHBsAg()HBV-DNA() HBeAg ()HBV-DNA()4. 4. 也可能出现也可能出现HBsAg(HBsAg() )，HBV-DNA(HBV-DNA() )。5. HBsAb (5. HBsAb () ) 、 HBcAb (HBcAb () ) 、
8、 HBeAb (HBeAb () )三抗体阳三抗体阳性性 与与HBV DNA 2.5 HBV DNA 2.5 103 copy /ml /ml 结果解释。结果解释。HBV(三)HBV-DNA定量检测的临床意义3. HBV-DNA定量与预后 a. 含量高者急性肝炎患者易慢性化 b. 癌变的几率明显高于含量低者 1. HBV-DNA定量与HBV复制水平及传染性2. HBV-DNA定量与乙肝药物疗效 a. 专家提出103 copy /ml做为阴性或临床治愈标准 b. HBV-DNA定量分析与干扰素干扰素治疗(前、中、后) c. 拉咪呋啶拉咪呋啶HBV(三)HBV-DNA定量检测的临床意义4. HBV
9、-DNA定量有助于指导怀孕与孕期，哺乳期检查5. 肝脏移植与HBV-DNAMazzaferro等报告：105copy /ml 发生了严重HBV再感染6. 血液制品和献血员的筛选HBV DNA检测的临床意义HBV DNAHBV DNA是是HBVHBV存在最直接的依据存在最直接的依据HBV DNAHBV DNA是是HBVHBV复制的标志复制的标志HBV DNAHBV DNA是患者具有传染性的标志是患者具有传染性的标志HBV DNAHBV DNA对乙肝两对半起补充作用对乙肝两对半起补充作用HBV DNAHBV DNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标HB
10、V DNAHBV DNA可检测出隐匿性慢性乙型肝炎可检测出隐匿性慢性乙型肝炎病毒特点： 1. 单正链RNA病毒 2. E1和E2区基因高度变异性（一）丙型肝炎病毒特点HCV感染特点：1.HCV在血中含量极微 2.输血后肝炎主要致病因子3.免疫学标志仅有抗-HCV，非中和抗体，产生时间不一4.有一部分人感染HCV后，不产生抗-HCV 5.感染易于慢性化(50-85%)6.疫苗研制尚不成功单链RNA(二)HCV-RNA定量检测的临床意义 1. 早期诊断 a. 临床以多少？，多少？，多少？具体值？多少？具体值？举例例如：试剂盒检测范围是例如：试剂盒检测范围是103108IU/ml,我们测我们测定的阴
11、性结果应报告定的阴性结果应报告 103 IU/ml；（；（无、含无、含量低量低）。中间值报告具体数据；当含量高于最）。中间值报告具体数据；当含量高于最高检测限时，报告高检测限时，报告108 IU/ml。（ 108 IU/ml； 109 IU/ml .） 参考范围参考范围?IU/ml与与COP/mlD的换算的换算-咨询厂家咨询厂家 3.5E+05 IU/ml-表示一毫升血清中有表示一毫升血清中有350，000个个HBV病毒微粒。病毒微粒。 HBVDNA的变化的变化在患者治疗过程中检测在患者治疗过程中检测HBVDNA定量，一般认为：定量，一般认为：其结果相差其结果相差5倍属正常波动，结果相差降低倍
12、属正常波动，结果相差降低10倍以倍以上才算治疗有效。上才算治疗有效。例如例如1有一患者治疗前检测有一患者治疗前检测HBV-DNA定量为定量为8.8E+06 IU/ml，治疗一月后复查为，治疗一月后复查为2.3E+07 IU/ml，两结，两结果相差果相差2.6倍。倍。（不一定是高了？）（不一定是高了？）如何向病人解释：如何向病人解释：属正常波动或者检测误差属正常波动或者检测误差（允许误差）（允许误差）例如例如2一患者治疗前检测一患者治疗前检测HBV-DNA定量为定量为9.2E+06 IU/ml；治疗一月后复查为；治疗一月后复查为2.8E+06 IU/ml，两结果相差，两结果相差3.3倍，不能说明治疗有效，需要继续观察。要有倍，不能说明治疗有效，需要继续观察。要有明显的下降明显的下降趋势趋势。检验报告单结果读取3.637E+06 检测下限: 1000拷贝/毫升3.637106 1.000E+03 copy/ml 如果是标本量是可以定量的，如血液、脑脊液等，则检测结果报告为：copy/ml如果是标本量不能定量，如分泌物等，则结果只能报告为：copy
