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1、文山野生金线莲总黄酮及多糖含量测定张志信，张铁，赵保发，胡国海，张仕秀【摘要】摘要：目的优选文山野生金线莲种质资源。方法通过测定不同种金线莲中的总黄酮及多糖含量，并以总黄酮及多糖含量为指标，挑选优质金线莲种质资源。结果6个野生金线莲样品中总黄酮含量根本一样，多糖含量相差较大，其中2号金线莲花叶开唇兰Anethilusrxburghii，叶片无明显叶脉的“金线莲公总黄酮含量最高，为43.01(g/gD);4号野生金线莲滇越金线兰Anethilushapaensis多糖含量最高为112.40(g/gD)。结论花叶开唇兰A.rxburghii及滇越金线兰A.hapaensis是文山野生金线莲中的优良
2、种质资源。【关键词】金线莲总黄酮多糖Abstrat：bjetiveTselettheptialgerplasresurefrtheildAnethilusplantsinenshan.ethdsInrdertgetthehighqualityidiplasresuresfAnethilushihhavehigherttalflavnidsandtheplysaharidentents,thententsfttalflavnidandtheplysaharideeredeterinedindifferentAnethilus.plants.ResultsTtalflavnidsntentsere
3、basiallythesae,andtheplysaharidententdiffereneasbigin6ildA.rxbarghiisaples.Thehighestntentfttalflavnidsas43.01(g/gD)in2#saple,andthehighestntentfpllysaharideas112.40(g/gD)in4#saple.nlusinA.rxburghiiandA.hapaensisarefinegerplassinenshanildAnethilus.Keyrds：Anethilus;Ttalflavnids；Plysaharide金线莲为兰科开唇兰属植
4、物花叶开唇兰Anethilusrxburghii(all.)Lindl的全草,是一种多年生珍稀名贵的中草药。我国南方广西、广东、贵州、四川、云南等省都有其丰富的药材资源，民间素有“药王“金草之美誉，主要用于治疗高血压并糖尿并心脏并肺炎、急性肝炎、肾炎、肿瘤等病症1。通过药理研究，其中的活性多糖和总黄酮被推测为该药材中的主要活性成分2。通过调查，文山野生金线莲分布于文山、砚山、西畴、马关和麻栗坡，但由于人为破坏，现今主要分布于文山东南部的西畴、马关和麻栗坡的原始森林中3，为了合理地开发金线莲资源，可进展组培快繁和人工栽培，解决市场需求。而通过组织快繁金线莲，种质资源选择是关键，因此对当地野生金线
5、莲中的主要活性成分总黄酮和多糖的测定具有一定的现实意义。在文山搜集的野生金线莲中，根据其叶片上的性状不同，从植株性状可分为3种，1种具有金黄色网状叶脉，民间称为“金线莲母的类群；第2种是网状叶脉和叶脉不明显的“金线莲公；第3种是叶片呈绿色，叶脉为白线的类群。1材料与仪器1.1仪器UV-2550紫外分光光度计日本岛津；AEL-40S十万分之一天平日本岛津；枯燥箱S-101-2S重庆实验仪器厂；KQ2200E医用超声波清洗器昆山市超声仪器，HH-2数显恒温水浴锅国华电器。1.2试剂芦丁对照品购于中国药品生物制品检定所；葡萄糖、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯。1.3药材18号金线莲全株于202
6、2-10分别采集，经文山师范高等专科学校生化系沐建华讲师鉴定无误见表1，样品洗净，于80枯燥至恒重，粉碎过60目筛备用。表1开唇兰属植物样品略2方法2.1总黄酮及多糖的提取流程称取金线莲材料1g，用滤纸包好置于脂肪抽提器中，用甲醇200l作溶剂提取，回流提取到提取液接近无色，停顿回流，搜集甲醇提取液，用甲醇定容至200l进展总黄酮含量测定；把残渣转到锥形瓶中，用选择好的提取工艺进展提取，得到提取液，用蒸馏水定容至800l进展多糖含量测定。2.2总黄酮测定方法2.2.1标准曲线的制作4精细称取120枯燥至恒重的芦丁对照品10g用20l乙醇溶解后，转移到100l容量瓶中，加水至刻度，摇匀即得溶液中
7、含无水芦丁的含量为0.1g/l。精细汲取芦丁标准液0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0l。分别置于50l容量瓶中，各加水至12l，加5%NaN2溶液2l，混匀，放置6in，加10%Al(N3)3溶液2l，混匀，放置6in,加4%NaH20l,再加水至50l，放置15in，以不加芦丁对照品的试剂作空白对照。按分光光度法在503n全波长扫描，在503n处有最大吸收波长处测定吸光度。以所取标准液含有的芦丁标样量g数和吸光度数据经回归处理，得到回归方程：Y=0.2196X-0.0112，相关系数r=0.9993。2.2.2总黄酮含量计算方法精细汲取1.0l多糖提取液，按“2.2.
8、1项下内容操作，再根据以下公式计算，测定结果。样品中的总黄酮含量以芦丁计：总黄酮含量g/gD=200式中：为1l样品液含黄酮量(g)，为金线莲样品质量(g)。2.3多糖测定方法52.3.1标准曲线的制作精细称取105枯燥至恒重的无水葡萄糖标准品25g，置于250l容量瓶中，加蒸馏水至刻度，配成0.1g/l的标准溶液。分别移取上述标准溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0l，依次加水使最终体积为1.0l，另取1.0l蒸馏水作为空白。每一试管中参加1.0l5%苯酚溶液，混匀，迅速参加5.0l浓硫酸，振摇5in后放置35in，在最大吸收波长490n处测定吸
9、光度，得回归方程：A=5.8824-0.0003，r=0.9954。其中A为吸光度，为葡萄糖浓度g/l。2.3.2多糖含量计算方法精细汲取1.0l多糖提取液，按“2.3.1项下内容操作，再根据以下公式计算，测定结果。样品中的多糖含量以葡萄糖计：多糖含量g/gD=800式中：为1l样品液含多糖量(g)，为金线莲样品质量(g)。2.3.3芦丁回收率的测定准确称取3号金线莲样品甲醇提取液取20l共3份，分别参加一定量的芦丁对照品，按“2.2.2项下操作。用紫外分光光度计测定吸光度，得出总黄酮含量，根据回收率公式计算出回收率。回收率%=混合后测得总黄酮含量-样品中总黄酮含量芦丁对照品参加量100%2.
10、3.4总黄酮测定精细度实验精细汲取3号金线莲样品甲醇提取液1l，共6份，按“2.2.2测定。2.3.5葡萄糖回收率的测定经过“2.3.3处理后的残渣用水作溶剂进展提取，得到的提取液取20l共3份，分别参加一定量的葡萄糖对照品，按“2.3.2项下方法操作。用紫外分光光度计测定吸光度，得出多糖含量，根据回收率公式计算出回收率。回收率%=混合后测得总黄酮含量-样品中总黄酮含量葡萄糖对照品参加量100%2.3.6多糖测定精细度实验经过“2.3.4处理后的残渣，进展水提，得到的提取液定容至800l，精细汲取1l，共6份，按“2.3.2项下方法测定。3结果与讨论3.1超声作用时间对多糖提取率的影响为了讨论
11、超声作用时间对金线莲多糖提取效果的影响，取1g3号野生金线莲样品，参加40l蒸馏水，水浴温度70，采用不同超声时间提取2次，按“2.3项下测定多糖含量。结果见表2。表2超声作用时间对多糖提取率的影响略由表2可以看出，随着超声时间的增加，提取率不断进步，当超声40in时，金线莲多糖的提取率最高，继续超声那么多糖的提取率呈现下降趋势，这可能是由于超声时间过长，导致溶剂挥发而造成的，故根据实验结果选择每次超声作用时间为40in。3.2提取温度对多糖提取率的影响为了讨论温度对金线莲3号多糖提取效果的影响，在其它条件一样的情况下，仅改变超声提取水浴温度，按“2.3项下测定多糖含量。结果见表3。表3提取温
12、度对多糖提取率的影响略由表3可以看出，随着超声提取水浴温度的上升，金线莲多糖的提取率呈现上升趋势，但当超声提取水浴温度超过70，溶剂的挥发量急剧加快，导致提取率下降，根据实验结果确定超声提取水浴温度为70。3.3液料比对多糖提取率的影响为了讨论液料比对金线莲3号多糖提取效果的影响，在其它条件一样的情况下，仅改变水和金线莲的体积质量比。结果见表4。表4液料比对多糖提取率的影响略由表4可以看出，当液料比为301时，多糖的提取率最高。液料比太小，溶剂缺乏以溶解足够多的溶质；而液料比太大，会增加超声波破碎细胞的阻力，使细胞破碎程度下降，从而降低多糖的提取率。综上所述，根据实验结果，选择液料比为401。
13、3.4超声提取次数对多糖提取率的影响为了讨论超声作用次数对金线莲多糖提取效果的影响，取1g金线莲3号样品，参加40l蒸馏水，水浴温度70，每次超声时间40in，分别提取1，2，3，4次，按“2.3项下测定多糖含量。其实验结果见表5。表5超声提取次数对多糖提取率的影响略从表5可以看出，随着提取次数的增加，多糖的提取率呈现增加趋势，对样品提取3次，金线莲中的多糖根本提取完全，故本实验选择超声提取3次。3.5芦丁回收率实验样品回收率实验结果见表6。由表6可以看出本实验的平均回收率为99.72%，相对标准偏向RSD%为1.858。表6芦丁回收率实验结果略3.6总黄酮测定精细度实验精细度实验结果见表7。
14、从表7可以看出，相对标准偏向为0.6093%，结果显示重复性较好，精细度较高。表7总黄酮精细度实验结果略3.7葡萄糖回收率实验结果见表8。由表8可以看出本实验的平均回收率为101.757%，相对标准偏向RSD%为0.487。表8葡萄糖回收率实验结果略3.8多糖测定精细度实验结果见表9。从表9可以看出，相对标准偏向RSD%为0.5402，结果显示重复性较好，精细度较高。表9多糖测定精细度试验结果略3.9文山野生金线莲中总黄酮及多糖含量分别精细称取不同品种的金线莲1g，按“2.1项下方法提取总黄酮及多糖，多糖提取采用以蒸馏水为溶剂，液料比lg401，提取水浴温度为70，每次超声时间40in，提取3
15、次，按“2.2及“2.3项下方法分别测定金线莲样品中的总黄酮及多糖含量。实验结果见表1011。从表1011中可以看出，不同类群的金线莲中总黄酮的含量相差不是很悬殊，但多糖的含量相差很大，应选择野生金线莲作为组培材料时，以多糖含量高者为优，故进展组织培养时，应该选择4，5号野生金线莲(即滇越金线兰A.hapaensis或西南齿唇兰A.ulEinensis)作为组培材料。表10不同品种金线莲总黄酮的含量测定略表11不同品种金线莲多糖的含量测定略4结论本实验确定了一套金线莲总黄酮及多糖的测定工艺，实验得出最正确的测定工艺为：首先以甲醇为溶剂，用脂肪抽提器对金线莲中的总黄酮进展提取，然后再用此残渣在超声条件下，采用以蒸馏水为溶剂，液料比lg401，提取水浴温度为70，每次超声时间40in，提取3次的工艺进展多糖含量的测定。采用此测定工艺，可以使用一份金线莲样品测定总黄酮及多糖两类活性成分，并使两类成分在含量测定时不互相干扰，从而使测定结果能更好地
