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1、大肠杆菌感受态细胞的制备标签：tr.,Ca.,co.分类： 细胞技术 感受态细胞 来源： 实验管理实验概要大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化实验原理处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之
2、获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Trans
3、formant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。主要试剂(1)0.1mol/L CaCl2溶液(2)LB液体培养基(3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。主要设备(1)超净工作台(2)冷冻离心机(3)恒温摇床(4)70冰箱(5)10mL移液管(6)吸耳球(7)1mL、200L移液枪（配
4、套枪头）(8)50mL 离心管(9)1.5mL离心管实验材料(1)大肠杆菌DH5（R-，M-，Amp-）实验步骤（一）受体菌的培养(1)从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5单菌落，接种于35mL LB液体培养基中，37下振荡培养过夜（12h左右）。(2)将该菌种悬液以1:100的比例接种，取250L菌液转接到25mL LB液体培养基中，37振荡培养23h至OD6000.5左右。（二）感受态细胞的制备（注意：以下操作在超净工作台完成。） (1)将菌液转入50mL离心管中，冰上放置10min。(2)在4下，4000r/min离心10min。弃去上清，将管倒置1min以便培养液流尽。(3)
5、用冰上预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液10mL轻轻悬浮细胞，冰上放置30min。(4)04 4000r/min离心10min，弃去上清，加入2mL预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置（务必冰上放置）。（注意：以上操作完成了新鲜感受态细胞的制备）（三）感受态细胞的分装与冻存(1)在2mL制备好的感受态细胞中加入2mL30%甘油（即1:1体积，甘油终浓度15%）。(2)将此感受态细胞分装成每份200L (1.5mL dorf管)，液氮速冻，快速转入-70冰箱保存。（如果没有液氮，可以将分装的感受态细胞直接转入-70冰箱保存。）注意事项、细胞的生长状态和密度 最好
6、从-70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已 经过多次转接，及贮存在4的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为05时，细胞密度在5107个/ml左右。（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。 此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。 、试剂的质量 所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配
7、制，最好分装保存于4。、防止杂菌和杂DNA的污染 整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。 、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。人人都爱protocol。 蛋白的纯化1.菌液离心取出三角瓶,倒入离心管中,离心(6000rpm,10min,4),离心之后,倒去上清.2.细胞重悬加上2mL的lysis buffer 洗沉淀,重悬细胞.lysis buffer 配方是HEPES (2M,PH 7.0)200l, N
8、acl (4M) 500l, DTT 3l, Brij 100l, PMSF 200l,H2O 19ml,共20ml体系.3.初步溶解 加入溶菌酶20l（100mg/ml）于重悬液中 ,然后冰浴20min.再用1.5ml EP管分装.4.冷冻将分装后的菌体放入-80冰箱里冷冻约20min（或者使用液氮快速冷冻细胞悬液）后, 取出待其融化。5.细胞破碎融化之后破碎细胞,用超声波细胞粉碎机破碎,每次10s, interval 20s, 20次.若量大可用压榨机来破碎.6.离心离心细胞破碎液,12500rpm,1h,4,然后收集上清并转另一个1.5ml管,再加100l 1M Tris -HCl bu
9、ffer(PH 8.0) 到上清中。（碱性有利于蛋白的获得）可以先放-80.7.纯化上清 准备Ni柱在试管中加上空柱,缓慢滴加300l的Ni柱于空柱中,待其完全沉淀（每300l树脂液中有5%Ni-NTA agnose）。再用2ml的AT buffer 平衡柱子（大约1h ）。AT buffer 配方：Tris-HCl 1M PH8.0 1000l,NaCl 4M 1000l,Brij 20l,DTT 3l, H2O 18ml. 上样加2ml上清到Ni柱中,并用2ml AT buffer 冲洗.(注意缓慢滴加) 洗脱样品加上1ml的salt washing buffer 冲洗,其配方是AT bu
10、ffer 8ml,NaCl 5M 2ml,Brij 100l.再加上1ml的Imidazole buffer（AT buffer 9.8ml ,Imidazole 1M 0.2ml）冲洗,洗去非特异性蛋白。 再洗脱目的蛋白用300l的Elution buffer 冲洗,获得所需的特异性蛋白. Elution buffer配方：AT buffer 7.5ml,Imidazole 1M 2.5ml.8.纯化细胞破碎液的沉淀用urea buffer 重悬细胞沉淀, 在常温温育1h,再离心(12500rpm 1h 4),收集上清,重复上清纯化步骤.urea buffer的配方是Tris-HCl 1M
11、PH8.0 1000l,NaCl 4M 1000l, Brij 20l, DTT 3l, urea 8M 18ml.其余buffer 均用urea buffer来配置.9.SDS-PAGE的鉴定配胶(根据此蛋白的大小（55KD）,配置12%的胶)下层胶的配方:Acr/Bis 4.44ml,下层胶缓冲液PH8.8 3.75ml,TEMED7l,10%APS75l,ddH2O6.8ml.上层胶的配方是: Acr/Bis0.75ml,上层胶缓冲液PH6.8 1.5ml,TEMED 4l,10%APS37.5l,ddH2O3.75ml.配置样品每管加样品2l,5loading buffer 4l,再加
12、ddH2O补全20l体系. 混合好loading buffer和样品后,在100下煮约5min,然后置室温下冷却后上样。样品1：纯化上清；样品2：纯化沉淀；对照1：未纯化上清；对照2：未纯化沉淀；对照3：标准甘油激酶上样添加样品,上样 20l,同时加上Marker,10l.电泳加上足够的电泳缓冲液(1),要加在两板内外,一定要浸没过板,形成电流通路.调好电压进行电泳,约1h后,loading buffer条带跑到底,便可停止.考马斯亮蓝染色 将电泳后的PAGE胶取下放入容器中,加入50ml双蒸水或去离子 水,加热至沸腾后停止,继续在脱色摇床上摇动5min,弃去水溶液. 加上染色液,以浸没胶面为
13、准,加热沸腾后保持状态30-60s,停止加热后继续在脱色摇床上摇动10min,弃去染色液. 加入约50ml的水,再加热至沸腾后保持沸腾状态30-60s,停止加热后在摇床上要5-10min,换水可完成脱色. 若要得到无背景的染色胶,可重复脱色步骤或将胶放在水中过夜.镍柱。用不同浓度的咪唑洗脱。因为咪唑和组氨酸都带正电，可在咪唑逐渐加大浓度的条件下洗脱目的蛋白。protocol里有啊。分离蛋白质混合物的各种方法主要是根据蛋白质在溶液中的以下性质：1）分子大小；2）溶解度；3）电荷；4）吸附性质；5）对其它分子的生物学亲和力等进行分离.常见的分离提纯蛋白质的方法有：1、盐析与有机溶剂沉淀：在蛋白质溶
14、液中加入大量中性盐,以破坏蛋白质的胶体性质,使蛋白质从溶液中沉淀析出,称为盐析.常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等.盐析时,溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好.凡能与水以任意比例混合的有机溶剂,如乙醇、甲醇、丙酮等,均可引起蛋白质沉淀.2、电泳法：蛋白质分子在高于或低于其pI的溶液中带净的负或正电荷,因此在电场中可以移动.电泳迁移率的大小主要取决于蛋白质分子所带电荷量以及分子大小.3、透析法：利用透析袋膜的超滤性质,可将大分子物质与小分子物质分离开.4、层析法：利用混合物中各组分理化性质的差异,在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离.主要有离子交换层析,凝胶层析,吸
15、附层析及亲和层析等,其中凝胶层析可用于测定蛋白质的分子量.5、分子筛：又称凝胶过滤法,蛋白质溶液加于柱之顶部,任其往下渗漏,小分子蛋白质进入孔内,因而在柱中滞留时间较长,大分子蛋白质不能进入孔内而径直流出,因此不同大小的蛋白质得以分离.6、超速离心：利用物质密度的不同,经超速离心后,分布于不同的液层而分离.超速离心也可用来测定蛋白质的分子量,蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比.蛋白纯化过程中,过完柱子后的上清称为什么?我们称为流穿液.蛋白过镍柱纯化的原理和步骤是什么？Ni柱中的氯化镍可以与有HIs（组蛋白）标签的蛋白结合,也可以与咪唑结合.步骤是：过柱子前可以选择Ni柱重生,也就是往柱子里倒氯化镍,一个柱长体积就行了,然后平衡柱子,拿你自己的buffer,给蛋白提供最适的环境,我一般平衡4个柱长,然后蛋白上样,你可以让他自己挂,这样挂柱子的效果好一些,如果流速太慢,可以加个恒流泵,但是一定不能太快,太快挂柱效果差,当然你也可以选择循环挂柱,就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯,从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去.挂完之后,按理想来讲,你的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了,杂蛋白多
