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1、提取方法对茶多酚氧化酶活性的影响 李立祥吴红梅（安徽农业大学农业部茶叶生物技术重点开放实验室合肥230036） 摘要本文采用不同缓冲液匀浆法及其浸提法、丙酮粉法提取茶多酚氧化酶，比较提酶方法对酶活性和酶剂活性的影响。结果表明：缓冲液匀浆法提取酶活性的效果优于珍酮粉法；匀浆浸提法提取酶活性的效果高于缓冲液匀浆法；并以柠檬酸盐缓冲液匀浆浸提法提取效果最好。而酶制剂的单位酶活性则是丙酮粉法较高，分别为缓冲液匀浆法及匀浆浸提法的1235倍。关键词提取方法茶多酚氧化酶酶活性酶制剂茶多酚氧化酶（氧化还原酶，PPO，EC.1.10.3.1）是茶中一类重要末端氧化酶类，它不仅在茶树生理代谢过程中起着重要的作用
2、，而且在茶叶加工中，尤其在红茶加工过程中对于催化多酚类物质的氧化变化也起着主导作用。茶氧化酶类的研究始于19世纪末20世纪初，近百年来人们进行了大量的研究和探索，已取得巨大的成就，但较多的集中于研究多酚氧化酶的性质、同工酶、活性及影响因子，而对多酚氧化酶的应用研究很少；随着当前茶色素研究的深入，体外应用酶促氧化茶多酚制取茶色素是未来趋势，开展茶多酚氧化酶应用研究尤为重要和迫切。笔者就茶多酚氧化酶提取方法对其活性的影响进行了研究，旨在为茶多酚氧化寻求较好的制备方法，为应用酶促茶多酚氧化制取茶色素奠定基础。1实验材料与方法1.1材料鲜叶采摘于安徽农业大学茶园福鼎大白茶品种一芽二叶及一芽三叶初展，洗
3、净后放入冰箱待用。1.2茶多酚氧化酶提取1.2.1丙酮粉法：称取洗净茶鲜叶（20冷冻）25g，放入组织捣碎机内，加225ml冷丙酮（20）捣碎5（即5min，下同）（3+2分两次进行，中间停5），然后迅速抽滤，滤渣用80%的冷丙酮洗至液体无色为止，所得的滤渣即为丙酮粉，干燥后的丙酮粉置于冰箱中备用。称取1g丙酮粉放于研钵中，加10ml0.1M柠檬酸0.2M磷酸氢二钠缓冲液，2g石英砂，2gPVP，冰浴研靡20，离心（400rpm）10，取上清液，即为粗酶液。1.2.2匀浆法：称取茶鲜叶（冷冻）25g，放入组织捣碎机内，加PVP50g，再分别加入冷藏的柠檬酸磷酸盐缓冲液（pH5.6）或柠檬酸盐缓
4、冲液（pH5.6）或磷酸盐缓冲液（pH5.8，已是最低pH值）。捣碎5（3+2分两次进行，中间停5），四层纱布抽滤，压挤法挤出滤液，滤渣放入研钵中，加入25g石英砂，25ml缓冲液于冰浴中研磨（匀浆5），尼龙布过滤，压挤法挤出滤液，把两次滤液合并，4000rpm离心10，取上清液即为粗酶液。1.2.3匀浆浸提法（亦又称匀浆法，但笔者为区别匀浆法将其称为匀浆浸提法）：将上述不同缓冲液匀浆法所制取的滤液分别取10ml，放置4冰箱中浸提12h，中间搅拌3次，离心（4000rpm）15，取上清液即为粗酶液。1.3PPO酶活性测定取粗酶液1ml，加2mlpH5.6的0.1柠檬酸盐缓冲液，加入反应混合液3
5、ml（反应混合液按0.1柠檬酸盐缓冲液pH5.6:0.1%脯氨酸:1%邻苯二酚10:2:3配制）；37恒温水浴锅保温10，立即加入1N偏磷酸0.7ml终止瓜，460nm波长处用10mm比色皿比色，空白混合液中用柠檬酸盐缓冲液pH5.6代替邻苯二酚。酶活性以每分钟OD460nm增加0.1为1个活力单位。2结果与讨论2.1提酶方法对PPO酶活性的影响茶叶酶学研究中影响酶活性的因素很多，缓冲液的组成、pH值、提酶温度、茶多酚除尽程度、匀浆方法及浸提等均影响酶的活性。本实验的结果（表1）可以看出，在提酶温度、PVP相同的条件下，缓冲液的组成和pH值对酶活性影响较大，酶活性表现为柠檬酸磷酸盐缓冲液柠檬酸
6、盐缓冲液磷酸盐缓冲液，pH5.6pH5.8，缓冲液pH值和组成不同对酶活性产生的影响达一倍；笔者采用缓冲液匀浆浸提法可获得较同类型缓冲液匀浆法高的酶活性，平均高出30%，与刘仲华和Roberts的结果相一致。同时，丙酮粉法对酶活性损失较大，其鲜叶总酶活性仅是缓冲液匀浆法和浸提法的1/5、1/7。很明显在茶PPO酶活性提取方面，缓冲液匀浆法和匀浆浸提法丙酮粉法具有优势。茶叶中PPO酶可分为液离态和束缚态两类，通常丙酮粉法所得的是PPO总酶活，而匀浆法所得则为可深性酶活性。Tween80增容、鲜叶萎凋和匀浆浸提均有利于洲离态可溶性酶活性提高。笔者研究的结果也证实了匀浆浸提对PPO酶活性确有提高；从
7、本实验和过去的研究可以看出，茶鲜叶中游离态和部分束缚态PPO酶以缓冲液匀浆法提取较为有利，一方面由于缓冲液匀浆法体积较大，酶蛋白易于溶出，采用浸提法可使束缚态的PPO酶部分转化为可溶性的酶溶出，提高PPO酶得率；另一方面缓冲液较接近茶鲜叶细胞液生理特性，酶溶出后活性损失较小。因此，茶样品PPO酶活性研究应选择缓冲液匀浆浸提法。表1提酶方法对酶活性及酶剂活力的影响方法鲜叶(g)酶液体积(ml)酶活性U/ml鲜叶酶活性(U/g)鲜叶总酶活性(U)酶液(粉)单位酶活性柠檬酸盐缓冲液匀浆法pH5.6匀浆浸提法412h253400.2543.45486.3600.254U/ml0.3314.502112
8、.5400.331U/ml磷酸盐缓冲液匀浆法pH5.8匀浆浸提法412h25367.50.1151.69142.2630.115U/ml0.1552.27956.9630.155U/ml柠檬酸磷酸盐缓冲液匀浆法pH5.6匀浆浸提法412h25356.60.2463.50887.6990.24U/ml0.3014.202107.3070.301U/ml丙酮粉法253.75g0.4060.60915.2254.06U/ml2.2提酶方法对酶剂活力的影响从鲜叶中提PPO酶的活性方面，丙酮粉法提酶效果最差，但其酶制剂中单位酶活性却很高，分别是缓冲液法及缓冲液浸提法的1235倍；丙酸粉法酶剂重量较少，仅
9、为缓冲液法及缓冲液浸提法的1/10，因此，丙酮粉法由于操作简便、体积小、易于贮存、酶剂活性较高，仍应是茶叶PPO酶提取酶制剂较好的方法。作为茶PPO酶的应用，酶制剂不仅要考虑酶活性得率，更要着眼酶制剂本身的活性、体积和应用性。缓冲液匀浆法虽然提取活性得率较高，但酶液本身活性不高，不得于酶的应用，尚需进行浓缩、提纯才能达到的应用要求；就目前国内条件而言，高活性PPO酶大量的生产尚不具备条件。相对而言，丙酮粉法虽对PPO酶提取活性损失较大，活性得率较低，但其酶粉本身活性尚可、体积小和便于贮存，只直接应用，因此具有茶PPO酶应用的优势。另据报导采用匀浆法和丙酮粉法二者结合的方法，提取茶鲜叶PPO酶，酶活性可达到200U/g，且体积较小，是一种很好的提酶方法。笔者亦进行了尝试性实验，未获得预想的结果，仍需继续进行研究。
