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1、兔VX2肝癌介入治疗后早期发生凋亡的流式细胞术检测【摘要】 目的 研究经肝动脉插管灌注碘油抗癌药乳液化疗栓塞和单纯灌注化疗后的早期兔肝VX2肿瘤发生凋亡。方法 27只新西兰大白兔瘤组织块种植肝VX2肿瘤，A组(n=9)经肝动脉灌注碘油抗癌药乳液,B组(n=9)肝动脉灌注化疗,C组(n=9)肝动脉灌注生理盐水，每组分别在处理后第24h、72h、120h处死实验兔各3只，采用FITCAnnexinV/PI流式细胞术分析介入处理后早期的肿瘤细胞凋亡。结果 肿瘤边缘部的凋亡早期细胞百分率与凋亡晚期细胞百分率及峰值时间点分别为：A组()%、()%、24h、72h,B组()%、()%、24h、24h,C组
2、()%、()%。肿瘤中心部的PapE、PapL与峰值时间点分别为：A组()%、()%、24h、72h,B组()%、()%、24h、24h,C组()%、()%。结论 LpTHACE诱导肝癌肿瘤细胞早期大量凋亡是其有效的主要作用机制，其诱导凋亡作用明显大于THAI。【关键词】 流式细胞术 凋亡 VX2肿瘤 肝脏 兔 肝动 化疗栓塞0 引言 利用兔VX2肝癌模型进行肝癌治疗学研究，近年已经取得了很大的进步，对指导临床治疗具有积极意义。目前临床上应用的多种非手术性肝癌治疗方法，对肝癌具有确切的疗效，其中经肝动脉碘油化疗栓塞或灌注化疗是目前治疗肝癌最主要最成熟的介入放射疗法。本文报告采用流式细胞术检测肿
3、瘤细胞膜完整性及膜转运功能的FITCAnnexin V/PI双染法，定量研究兔VX2肝癌LpTHACE和THAI后早期发生的凋亡，探讨其治疗机制。1 材料和方法27只新西兰大白兔，体重每只平均kg，雌雄不限,开腹直视下兔肝左中叶瘤组织块接种建立兔VX2肝癌模型。接种后第3周进行血管造影和介入处理。直视下穿刺右侧股动脉行腹腔动脉、肝固有动脉插管，非离子型造影剂优维显，DSA方式血管造影。将实验兔分为3组 A组(n=9)LpTHACE,经肝固有动脉灌注碘油抗癌药乳液(Lipiodol + epirubicin )；B组(n=9)THAI，经肝固有动脉灌注epirubicin , C组(n=9)为对
4、照组,经肝固有动脉灌注静脉用生理盐水2ml。每组分别在介入处理后第24h、72h、120h空气栓塞法处死实验兔各3只，立即在肿瘤的中心部位、近包膜的肿瘤边缘部位各取大小为5mm5mm5mm瘤块，按实体瘤单细胞悬液制备法制成单细胞悬液，用作流式细胞仪分析。FITCAnnexinV/PI双染色双参数流式细胞分析法 采用FACS Vantage流式细胞分析仪(美国Becton Dickinson公司)，激发光光源波长为488nm的氩离子激光器。FITCAnnexin V/PI双染法流式细胞分析试剂盒Bender公司产品：BMS306FI/100T，Annexin VFITC Kit (incl. A
5、nnexin V staining buffer and propidium iodide)，按说明进行双染操作。每个样本检测计数的细胞数量均固定为10 000个，应用CELLQuest软件获取、分析输出试验数据。统计学分析 采用SPSS 软件，GLM方差分析。以为有显着性意义，为有非常显着性意义。2 结果FCM术 FITCAnnexin V/PI双染法检测散点图表示检测结果,见图1。肿瘤边缘部 A组、B组和C组对肿瘤边缘部位的影响及变化趋势，见表1、图2。 散点图左下象限LL：正常细胞簇群，Annexin V-PI-；右下象限LR：凋亡早期细胞簇群，Annexin V+PI-，右上象限UR：
6、凋亡晚期细胞或死亡细胞簇群，Annexin V+PI+；左上象限UL：机械损伤或坏死细胞簇群,Annexin V-PI+图1 LPTHACE组兔第24h点肿瘤中心部位细胞凋亡FCM散点图肿瘤中心部位 A组、B组和C组对肿瘤中心部位的影响及变化趋势,见表2、图3。3 讨论 LpTHACE和THAI治疗肝癌的机理目前仍不十分明了，有学者研究经肝动脉化疗栓塞相当长一段时间后的人肝癌手术切除标本，发现存在肝癌细胞凋亡1。对于在经肝动脉介入治疗后的早期肝癌细胞凋亡，目前尚缺乏研究报告。本研究采用兔VX2肝癌模型和FITC Annexin V/PI流式细胞术对此进行了初步探索，其结果表明，LpTHACE和
7、THAI诱导肝癌在治疗后的早期发生了明显的肿瘤细胞凋亡，诱导肿瘤细胞发生早期凋亡是经肝动脉介入治疗肝癌最基本的机制之一。表1 FCM术FITCAnnexin V/PI双染法检测肿瘤边缘部肿瘤细胞凋亡百分率表2 FCM术 FITCAnnexin V/PI双染法检测肿瘤中心部位肿瘤细胞凋亡百分率注：表1、2内各组数值右上角标注的代表意义为:同一方法不同时间点比较：2472 h，同一时间点不同方法比较：THAETHAI图3 肿瘤中心部位 TAE组、TAI组和对照组在不同时间点的瘤组织凋亡早期细胞百分率、凋亡晚期细胞百分率变化图 先前的观点认为经肝动脉介入治疗引起肿瘤组织发生凝固性坏死，但是光学显微镜
8、难以分辨凝固性坏死与凋亡性坏死。文献上对于凋亡过程晚期细胞与坏死细胞的概念比较模糊，流式细胞术也不能将两者分开。但是双参数流式细胞术FITCAnnexin V/PI双染法可以区分处于凋亡过程早期细胞、凋亡过程晚期细胞以及未发生凋亡变化的活细胞，能明确定量处于凋亡早期的细胞族群，被认为是定量检测细胞凋亡的理想方法。本研究采用这一方法将凋亡早期细胞凋亡晚期细胞分开进行分析，明确显示THACE后早期具有较高水平的凋亡早期细胞百分率和相对高的凋亡晚期细胞百分率。如果综合计算处于凋亡早晚二期的细胞百分率，则可看出THACE后的早期肿瘤组织呈现出高水平凋亡状态。在凋亡检测方法中，TUNEL法也被认为是灵敏
9、度较高的方法，其凋亡检出率与Annexin V/PI中的凋亡早期细胞百分率加凋亡晚期细胞百分率之和无显着性差异2,3。本研究的结果也提示，流式细胞术法分析早期肿瘤细胞凋亡在定量定性方面都比TUNEL法更加精确。 单纯碘油或单纯化疗药物肝动脉灌注其作用都非常有限，本研究中碘油化疗栓塞组VX2肝癌早期细胞凋亡水平为动脉灌注化疗的23倍，说明以碘油作为抗癌药物载体使局部抗肿瘤作用明显增强，这与临床上LpTHACE治疗肝癌疗效明显优于单纯THAI呈高度一致性。LpTHACE法碘油抗癌药乳液在肝肿瘤内聚积时间较长且对肿瘤微循环有栓塞作用，THAI法抗癌药对肝肿瘤的作用呈一过性，两种方法作用强度和作用持续
10、时间的不同可能是诱导凋亡水平差异的重要原因。 本研究中对照组肿瘤细胞凋亡率呈相对稳定的低水平状态，经LpTHACE和THAI处理后早期的肿瘤细胞凋亡呈现随时间变化规律。THACE组呈现24h凋亡早期细胞百分率高峰和72h点凋亡晚期细胞百分率高峰且后者大于前者，72h和120h点的凋亡晚期细胞百分率显着高于凋亡早期细胞百分率，早期细胞凋亡在120h点已呈明确下降趋势。结果提示在LpTHACE后的早期肿瘤细胞死亡可能主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的，碘油化疗栓塞对肝癌的作用主要集中在治疗后一段相对较短的时期，两次碘油化疗栓塞的时间间隔对疗效可能是一个重要的影响因素。单纯THAI诱导的凋亡早期细胞
11、百分率和凋亡晚期细胞百分率都以24h点为最高，随时间而快速下降。经留置导管持续灌注，保持较长时间肿瘤局部相对高药物浓度，可能会增加THAI诱导凋亡的时间与峰值效率。 在本研究中，肿瘤中心部位处于凋亡早期的细胞百分率和处于凋亡晚期的细胞百分率都大于周边部位，可能肿瘤中心部分对凋亡诱导因子比周边部更加敏感，或者肿瘤周边部生长活跃对凋亡的抗力较大，因此需要进一步研究如何诱导肿瘤周边部高凋亡，以充分提高疗效。【参考文献】 1 XIAO Enhua, HU Guodong, LIU Pengcheng, et al. A study on apoptosis of hepatocellular carc
12、inoma cells after transarterial chemoembolizationJ. Chin J Radiol, 1999,33 (3): 153155. 2 Span LF, Pennings AH, Vierwinden G, et al. The dynamic process of apoptosis analyzed by flow cytometry using AnnexinV/propidium iodide and a modified in situ end labeling techniqueJ. Cytometry, 2002,47(1):2431.3 郑骏年,谢叔良,陈家存,等.流式细胞术定量检测细胞凋亡三种方法的比较研究J.中国免疫学杂志, 1999,15(10): 467469.
