线粒体膜分离

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1、线粒体膜分离线粒体膜分离方法主要是密度梯度离心1.配液：(1) 10mmol/L PBS pH7.4。(2) 0.25mol/L 蔗糖-10mmol/L Tris-HCL pH7.4。(3) 用 10mmol/L Tris-HCL pH7.4 配制 25.2%、37.7%、51.7%、61.5%(w/v)的蔗糖液。2 .操作步骤全部操作在冰浴中进行，溶液须预冷。(1) 纯化的线粒体悬浮在10mmol/L PBS、pH7.4中膨胀20分钟，再以105000g离心60分钟，弃上清液，沉淀含内外膜。沉淀重 悬浮于0.25mol/L蔗糖-10mmol/L Tris-HCL pH7.4中以11500g离

2、心15分钟，上清液用于分离线粒体外膜，沉淀用于分离线粒体 内膜。(2) 线粒体外膜的分离： 吸取上述上清液，以105000g离心60分钟，弃上清沉淀重悬于适量的0.25mol/L蔗糖-10mmol/L Tris-HCL溶液中。 用带长针头的注射器分别吸取3mL的25.2%、37.7%、51.7%蔗糖溶液，并以叠层铺在超速离心管中，制备不连续的密度梯度。 吸取2mL样品液小心加在25.2%蔗糖溶液的界面上。 以165000g离心45分钟，线粒体外膜处在样品液与25.2%蔗糖溶液的交界面上，用注射器收集线粒体外膜。(3) 线粒体内膜分离： 把11500g离心15分钟后的沉淀物重新置于适量的25.2

3、%蔗糖溶液中。 用注射器吸取2ml的25.2%蔗糖溶液，另外分别吸取2.5m L的37.7%、51.7%、61.5%的蔗糖溶液，然后依次叠加超速离心管 中，制成不连续的密度梯度。 吸取1.9mL样品液，加在25.2%蔗糖溶液界面上，以77000g离心90分钟，作第一次分离，在37.7%与51.7%蔗糖溶液界面 下为内膜区带。 吸出内膜区带，加8倍体积蒸馏水并再次匀浆，然后以85000g离心30分钟，弃上清液，沉淀悬浮在0.25mol/L蔗糖溶液中。 分别取7.5mL的37.7%、51.7%、61.5%的蔗糖溶液，在离心管中制成不连续的密度梯度。 吸取初步分离的内膜样品液7.5ml加在37.7%蔗糖溶液的界面上。