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1、实验2柱色谱分离植物色素（一）实验目的1.通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法；2.了解柱层析的基本原理,掌握柱层析的操作技术。3.通过柱色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理。（二）实验原理层析法是一种物理分离方法。柱层析法是层析方法中的一个类型，分为吸附柱层析法和分配柱层析法。本实验仅介绍吸附柱层析法。吸附柱层析法是分离、纯化和鉴定有机物的重要方法。它是根据混合物中各组分的分子结构和性质（极性）来选择合适的吸附剂和洗脱剂，从而利用吸附剂对各组分吸附能力的不同及各组分在洗脱剂中的溶解性能不同达到分离目的。吸附柱层析法通常是在玻璃层析柱中装入表面积很大、经过活化的
2、多孔性或粉状固体吸附剂（常用的吸附剂有氧化铝、硅胶等）。当混合物溶液流过吸附柱时，各组分同时被吸附在柱的上端，然后从柱顶不断加入溶剂（洗脱剂）洗脱。由于不同化合物吸附能力不同，从而随着溶剂下移的速度不同，于是混合物中各组分按吸附剂对它们所吸附的强弱顺序在柱中自上而下形成了若干色带，如图所示。在洗脱过程中，柱中连续不断地发生吸附和溶解的交替现象。被吸附的组分被溶解吸出来，随着溶剂向下移动，又遇到新的吸附剂颗粒，把组分从溶液中吸附出来，而继续流下的新溶剂又使组分溶解而向下移动，这样经过适当时间移动后，各种组分就可以完全分开，继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分随溶剂首先流出，再继续加溶剂直至各组分依
3、次全部由柱中洗出为止，分别收集各组分。绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a和叶绿素b，其差别仅是a中一个甲基被b中的甲酰基所取代。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素a的含量通常是b的3倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。胡萝卜素是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体，即a-,B-和Y-胡萝卜素，其中B-异构体含量最多，也最重要。在生物体内，B-体受酶催化氧化即形成维生素A。目前B-胡萝卜素已可进行工业生产，可
4、作为维生素A使用，也可作为食品工业中的色素。叶黄素是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。本实验是用活性氧化铝作吸附剂，分离菠菜中的胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a和叶绿素b。（三）主要试剂与仪器研钵、布氏漏斗、圆底烧瓶、直形冷凝管、层析柱，抽滤瓶，烧杯，铁架台，脱脂棉，海沙，中性氧化铝，乙醇，石油醚（6090C）,丙酮，菠菜叶（四）操作步骤1.菠菜色素的提取称取5g洗净后的新鲜的菠菜叶，用剪刀剪碎后放入研钵，稍加研磨后加入约15mL3:2（体积比）的石油醚/乙醇混合液，继续研磨约5min，然后用布氏漏斗抽滤菠菜汁，弃去滤
5、渣。（可以用相同的方法再提取一次，合并滤液）将滤液转入分液漏斗，加入30mL水萃取洗涤（分两次，每次15mL），以彻底除去萃取液中的乙醇。洗涤时要轻轻旋荡，防止产生乳化。处于上层的石油醚层用无水硫酸钠干燥后滤入圆底烧瓶，在水浴上蒸去大部分石油醚至体积约为2mL为止。2. 装柱取一支洁净干燥的层析柱玻管，自柱口塞入少许脱脂棉并用长玻棒推至柱底压平（塞时不宜太紧）。从柱口小心装入活性氧化铝（160200目,于300-400C活化34小时），边装边轻轻敲打层析柱，使填装紧密均匀，直至氧化铝粉柱高达8厘米时为止。然后在柱顶再加上一层0.5cm高的海沙。将此层析柱固定在铁架台上，下面接一个干净的抽滤瓶，
6、装置如图所示。3加样打开层析柱下端活塞，将抽滤瓶与水泵相连，抽气减压。用小烧杯从柱口沿管壁小心加入石油醚流出（切勿把氧化铝表面冲乱）。当柱顶尚留有12ml石油醚时，停止减压（使用前抽滤瓶应该干燥，这样回收的石油醚倒出后，可以用于配制洗脱液），加入混合溶液2ml（预先准备好的浓缩液）。待色素全部进入柱体后，在柱顶小心加洗脱剂石油醚/丙酮溶液9:1（体积比）。打开活塞，让洗脱剂逐滴放出，层析即开始进行，用锥形瓶收集。当第一个有色成分即将滴出时，取另一锥形瓶收集，得橙黄色溶液，它就是胡萝卜素。用石油醚-丙酮7:3（体积比）作洗脱剂，分出第二个黄色带，它是叶黄素。再用丁醇/乙醇/水3:1:1（体积比）
7、（或者用石油醚一丙酮（1:1）溶液）洗脱叶绿素a（蓝绿色）和叶绿素b（黄绿色）。收集各色带后,转入棕色瓶低温保存。五.注意事项1. 层析柱装填紧密与否，对分离效果影响很大。若柱中留有气泡或各部分松紧不匀（更不能有断层）时，会影响渗透速度和显色的均匀。2. 在吸附柱上端加入海沙是为了加样品和洗脱剂时不致把吸附剂冲起，影响分离效果；在吸附柱下端加入脱脂棉是为了防止吸附剂细粒流出。3. 为了保持吸附柱的均一性，应该使整个吸附剂浸泡在溶剂或溶液中，即从第一次注入乙醇起直至实验完毕，绝不能让柱内液体之液面降至沙层之下。否则当柱中溶剂或溶液流干时，会使柱身干裂。若再重新加入溶剂，会使吸附柱的各部分不均匀而影响分离效果。思考题1. 为什么极性较大的物质要用极性较大的溶剂洗脱？2. 层析柱中若留有空气或装填不匀，会怎样影响分离效果？如何避免？3. 试比较叶绿素、叶黄素和胡萝卜素三种色素的极性，为什么胡萝卜素在层析柱中移动最快?
