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1、分子生物学综合实验论文题 目:绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达中国黄石2010年12月绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆与表达胡丽丹(湖北师范学院生命科学院0803班湖北黄石43500)摘要:绿色荧光蛋白(GFP)是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物 体内的生物发光蛋白。用碱裂解法提取的的质粒pEGFP-N3和pET-28a经过 BamH I和Not I双酶切连接后,得到pET-28a-pEGFP-N3重组质粒。取部分的重 组质粒做酶切实验,验证重组质粒的存在性,剩下的重组质粒导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中。重组有GFP基因的E. coLi BL-21,在含
2、有1 pL/mL 的卡纳霉素的LB培养基上培养。当A600达到0.7时,用终浓度为0.8 mM的异丙 基硫代-B-D-半乳糖苷(IPTG)诱导培养3小时,离心得到下层绿蓝色沉淀物即 可。关健词:绿色荧光蛋白GFP基因的克隆 荧光蛋白 水母CLoning and Expression of Green FLuorescent Protein GeneHU Li-Dan(Class three Grade eight, College of Life Sciences department,Hubei Normal university ,Huangshi 435000)Abstract: Gre
3、en fluorescent protein(GFP) ,one kind of bioluminenscent proteins ,hasbeen found existing in the internal of Coelenterates,such as fellyfish,polyp and coral pEGFP-N3 and pET-28a was harvested by sodium dodecylsulfate(SDS) alkaline process extraction and Agarose Gel Electrophoresis.After treating the
4、 two targeted plasmids with BamHI and Not I, the recombinant plasmid,namelypET-28a-pEGFP-N3, can be retrieved by furthermore Agarose Gel Electrophoresis.Taking slight recombinant plasmid proves that recombinant plasmid does exist by dienzyme cutting(BamH I and Not I).The recombinant plasmid lefting
5、would be transported to E. coLi BL-21 the competent cells. E. coLi BL-21 containing recombinant GFP gene was grown overnight in LB solid medium containing kanamycin (Final concentration: 1 pL/mL). When absorbance at 600 nm value was 0.7, isopropyL p-D-thiogalactopyranoside was added to 0.8 mM and th
6、e incubation was continued an addition 3 h.Key words: Green fluorescent protein Fellyfish Genetic Cloning Fluorescin目录1.前言:.1L1 绿色荧光蛋白(GREEN fluorescent protein,gFP) 11.1.1 GFP研究背景11.1.2 GFP研究应用21.2基因的克隆与表达32. 实验试剂及实验仪器:52.1实验试剂与材料: 62.2实验仪器:73. 实验方法73.1质粒提取方法:73.2琼脂糖凝胶电泳及回收: 93.3酶切及连接:113.4E. coLi
7、DH5a或E. coLi BL21感受态制备及转入: 123.5酶切验证重组质粒: 133.6GFP基因的表达143.6.1活化菌种143.6.2扩大培养143.6.3 IPTG诱导GFP基因的表达144. 结果与分析144.1质粒提取过程中现象与结果: 144.2琼脂糖凝胶电泳154.3E. coLi DH5a或E. coLi BL21感受态制备及转入结果: 164.4酶切验证重组质粒164.5 GFP基因的表达结果: 175. 讨论: 185.1提取质粒出现图六的原因是: 185.2琼脂糖凝胶电泳出现图七、图八原因:185.3 E. coLi DH5a或E. coLiBL2 1感受态制备及
8、转入出现图九、十原因:.195.4酶切验证重组质粒出现图十一原因: 195.5 GFP基因的表达结果如图十二、十三原因: 196. 参考文献20前言:1.1 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)1.1.1 GFP研究背景绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生 物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时,GFP发射绿色荧光1。日本科学家 下村修1962年第一次从一种水母中发现了绿色荧光蛋白,如图一所示。这种蛋白在紫外线光中呈现绿色,这种水母 体内含有一种生物发光蛋白质 aequorin,但它本身发蓝光,通过对光谱 的研究,下村修提出了发光景
9、水母所发的绿 光是因激发的水母素向绿色荧光蛋白图一:夜晚水母体内GFP显色4Figure1 Chromogenic GFP in Fellyfish at night4发生的荧光能量转移所致。即水母素作为一种能量供体,而绿 色荧光蛋白成为能量受体。水母素和绿色荧光蛋白都有重要的 应用,但水母素是荧光酶的一种,它需要有荧光素底物,经过 酶促反应后发光。GFP能把这种光转变成绿色,也就是当水母容光焕发的时候我 们实际看到的颜色。其在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下呈现强烈绿 色2。1987年,道格拉斯普莱沙(Douglas Prasher)克隆出了 GFP的基因序列。1993年,在普莱沙的基础
10、上,马丁沙尔菲(Martin Chalfie)成功地通过基因重 组的方法使得除水母以外的其他生物(如大肠杆菌等)也能产生GFP,这不仅证 实了 GFP与活体生物的相容性,还建立了利用GFP研究基因表达的基本方法, 而许多现代重大疾病都与基因表达的异常有关。至此,生物医学研究的一场“绿 色革命”揭开了序幕。此后,谢尔盖路基亚诺夫(Sergey A. Lukyanov)又从一种珊瑚中分离出了 与绿荧光蛋白类似,但能发出红色光的荧光蛋白,预示着荧光蛋白可以有不同的 颜色。美籍华人钱永健(Roger Y Tsien)系统地研究了绿荧光蛋白的工作原理,。 钱永健还对绿色荧光蛋白进行了颜色突变。不同颜色可
11、以同时在同一个细胞或组 织内标记多种蛋白或结构。多种颜色的绿色荧光蛋白的出现 为研究蛋白之间的相互作用、蛋白分解等提供了无限的可能性。现在世界各地实验室使用的GFP , 都是经过改造优化了的,而钱永健是这方面的先驱和领先人物2。1996年GFP的晶体结构被解出,蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构,如 图二.长420 nm,宽240 nm,由11个围绕中心a螺旋的反平行。折叠组成,荧 光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖,底 部由一个短的垂直片段覆盖,对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色 团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身环化和氧化形成
12、。图二:GFP晶体结构Figure2 Crystal structure of GFP图三:质粒pEGFP-N35Figure3 pEGFP-N3 52001年1月11日,美国科学家宣布培育成世界上首只转基因猴,这是世界 上首次培育成功转基因灵长类动物.添加在这只名为安迪的猴子体内的就是这 种标志基因。1.1.2 GFP研究应用在生物学研究中,科学家们更多的是利用这种能自己发光的荧光分子来作为 生物体的标记。将这种荧光分子通过化学方法挂在其他不可见的分子上,原来不 可见的部分就变得可见了。生物学家一直利用这种标记方法,把原本透明的细胞 或细胞器从黑暗的显微镜视场中“纠出来”。但传统的荧光标记在
13、发光的同时,会产生具有毒性的氧自由基,导至被观察 的细胞死亡,这叫做“光毒性”。因此,在GFP发现以前,科学家们只能通过荧 光标记来研究死亡细胞静态结构。相反,绿色荧光蛋白对生物体无毒无害,分子 量小,方便构建载体,同时在多种非水母的生物体中均可稳定表达并易于检测, 所以,作为一种生物分子标记,具有广泛的应用前景3。由于GFP荧光是生物细 胞的自主功能,是一种现成的荧光蛋白质,荧光的产生不需要任何外源反应底物, 因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无 法比拟的。本实验是利用实验室提供的质粒PEGFP-N3,其结构如图三所示.其上有 所用酶的酶切位点。1.2基因
14、的克隆与表达基因克隆(分子克隆molecular cloning)-通过体外重组技术,将一段目的 DNA经切割、连接插入适当载体,并导入受体细胞,扩增形成大量子代分子的 过程。如下图四所示:所需元件:限制性内切酶:BamH I和Not I(BamH I的切点为:5-GGACC-3Not I 的切点为 5-GCGGCCGC-33, -CCTAG;G-5,3 -CGCCGGJCG-5载体:E. coLi DH5a(1.易于接纳外源DNA。2.无特异的内源性核酸内切酶3. 载体复制、扩增不受阻4.与质粒有互补性)受体细胞:E. coLi BL-21(1.易于接纳外源DNA。2.无特异的内源性核酸内切
15、酶 3.载体复制、扩增不受阻4.与载体有互补性)目的基因:pEGFP-N3选择标记基因:pET-28a (同时含有抗kana的基因有助于后面选择,和。-半乳糖 苷酶基因可被异丙基硫代-P-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的基因GFP)连接:平末端连接(相同酶切产生互补的粘性末端,再通过碱基互补配对连接)连接醇ICansLE 平模图四:基因克隆的过程Figure4 Process of gene cloning原核基因表达系统(Gene Expression):由于目前对原核生物基因结构了解的要透彻一些,所以一般将目的基因导入到原 核生物中。将外源基因引入原核细胞,并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效 地表达、合成基因产物的体系。如图五所示。为提高G