第十三章 生物实验的基本技术第一节 细胞学实验技术【知识概要】一、玻片标本的制作技术制作玻片标本对认识生物体的形态结构具有重要意义玻片标本有临时玻片标本（如涂片、压片、临时装片）和永久玻片标本（如永久装片、切片）1．涂片法涂片法是将材料均匀地涂布在载玻片上的一种制片方法涂片材料有单细胞生物、小型藻类、血液、细菌培养液、动植物的疏松组织、精巢、花药等涂片时应注意：（1）载玻片必须清洁2）载玻片要持平3）涂层须均匀涂抹液滴在载玻片中间偏右，用解剖刀刃或牙签等涂匀4）涂层要薄用另一载玻片作推片，沿滴有涂抹液的载玻片面（二载玻片夹角应为30°～45°）由右向左轻轻推动，涂成均匀一薄层5）固定如需固定可用化学固定剂或干燥法（细菌）固定6）染色细菌用亚甲基蓝，血液用瑞氏染液染色液要盖住全部涂面7）冲洗用吸水纸吸干或烤干8）封片长期保存用加拿大的树胶片片2．压片法压片法是将生物材料置于载玻片和盖片之间，施加一定压力，将组织细胞压散的一种制片方法压片法的一般过程：（1）取材观察细胞分裂，应选取细胞分裂旺盛、新鲜的组织细胞为材料如根尖、茎尖分生组织、骨髓细胞、花药（花粉母细胞）精巢（精母细胞）等2）固定。
材料固定可根据需要而定，取材后立即压片观察，可不作单独固定处理（与染色同步进行）；取材后不立即视察，可将材料用固定液（一般用醋酸酒精固定液）固定固定2～24小时（因材料而异）后用95％乙醇清洗，保存于70％乙醇中，备用3）离析对细胞不易散开材料用水解分离液（如1N HCl或盐酸一酒精液）处理，一般处理6～20min，解离后经水漂洗后方能染色4）染色染色剂种类很多观察染色体常用醋酸洋红染色液染色5）压片将材料放在载玻片上，加一滴清水或染液，盖上盖玻片用拇指轻轻压片6）观察压片后，即可在显微镜下观察3．装片法装片法是将生物材料采取整体封固制成玻片标本的方法，用此法可制成临时或永久装片装片材料有：微小生物如衣藻、水绵、变形虫、水螅，植物的叶表皮；昆虫的翅、足、口器，人的口腔上皮细胞等装片法制作时应注意：（1）手持载玻片时，应注意持平，或放在平台上滴水时水量要适当，以恰好被盖玻片盖满为度2）应将材料用解剖针或镊子展开不使重叠，展平在同一平面上3）放盖玻片时，从一侧慢慢盖在水滴上，防止出现气泡4）染色时，将一滴染色液滴在盖玻片的一侧，用吸水纸从另一侧吸引，使盖玻片下的标本均匀着色着色后，用同样的方法，滴一滴清水，把染色液吸出后，在显微镜下观察。
二、显微镜基本实验技术1．低倍镜（4X、10X）的使用方法显微镜操作主要包括两个方面：（1）光度调节正确对光是能否成功地观察到物象的首要条件对光时，先把聚光器上提，打开可变阑，转动反光镜，这时一边看镜内视野，一边调节聚光器螺旋，直至视野内得到均匀而明亮的光线2）焦距的调节调焦时，先把观察的切片，用推进器对正通光孔中央然后分两步调焦先用粗调器定焦，用左眼看目镜，使粗调器慢慢上升，直到能清楚地看到标本为止随后调节细调器，使镜筒微微升降，至物象更清晰为止2．高倍镜（40X）的使用方法（1）将在低倍镜中找到的物象欲放大部分移到视野中央2）转动物镜转换器，使40X物镜对准通光孔，转动时从侧面注视物镜，以防镜头紧压玻片3）调节细调螺旋，使物象清晰3．油镜（100X）的使用方法（l）先用低倍镜找到欲观察细微结构，将其结构移至视野中央换高倍镜2）下降镜台，在玻片标本上滴一滴香柏油，转换油镜从侧面注视油镜，把镜台上升，使油镜头浸在香柏油滴中3）转动细调螺旋，使物象清晰，进行观察4）观察完毕，用镜头纸擦去油镜头和玻片上的香柏油，再用少许二甲苯或乙醚 / 无水乙醇把镜头擦干净4．安装指针的简易方法将目镜的上盖（一片透镜）旋下，剪取一小段头发（其长度约等于目镜的半径），用镊子夹住一端，将另一端蘸少许中性胶，将其粘在目镜内壁的金属光栏（一铁圈）上。
稍干后，旋紧上盖，即可使用三、单细胞的计数方法在细菌培养和体外细胞培养，以及环境监测血液检查中常常需要统计细菌、细胞、单细胞藻类、原生动物、血细胞、花粉等数量细胞计数方法的原理是把一定体积的细胞液体，在显微镜下直接计算其个数，利用所得结果推算出每毫升水体中的单细胞数具体方法如下：1．水滴计数法用管口圆而平滑、大小适宜的吸管，吸取1mL水，然后测定这一吸管1rnL水可滴出多少滴水（反复测定，直到准确为止）这样可以计算出该吸管滴出的每一滴水的体积用吸管取样时，如果单细胞是活动的要用碘杀死后，再计数；如果样品浓度太大，计数困难，按倍数稀释到适宜的浓度；另外，取样前必须搅拌，搅拌后，立即取样取样后，在显微镜下计数，得到一滴水中细胞数的平均值后，可依下列公式求出1mL水体中所含细胞的数目1mL水体中含细胞数＝计数平均值×定量吸管每毫升的滴数×稀释倍数2．血球计数板计数法血球计数板是由一块厚玻片特制而成，其中央有两个计数室每个计数室划分出9个大方格（见下图），每格面积1mm2，加盖玻片后的深度为0.1mm因此，每大方格容积为0.1mm另外，中央大方格以双线等分为25个中方格每个中方格又分16个小方格，供细胞计数用。
1 2 3 4血球计数板的构造l．顶面观 2．侧面观 3．放大后的网格 4．放大后的计数室计数方法：首先用吸管吸取少许稀释倍数的单细胞悬液，从盖片端滴一小滴（不宜过多），液体自行向内渗入，静置数分钟后，再放在微镜下观察计数一般选取计数室内四个角及中央五个中方格（80小方格）计数，若细胞位于小方格的线上，应遵循“数上线不数下线，数左线不数右线”的原则，以减少误差计数应重复3次，取其平均值数完毕后，依下式计算：每1mL悬液细胞数或每克细胞数＝80个小方格细胞总数 / 80×400×10000×稀释倍数四、显微测微尺的应用方法显微测微尺是在显微镜下测量生物细微结构的测微工具，用它测量细胞各部分的厚薄和大小显微测微尺（见下图）包括目镜测微尺（目尺）和物镜测微尺（台尺），测量时须将其配合使用方可达到测量目的目镜测微尺为一圆形玻片，玻片中央有一横线刻有大小格的等距离线物镜测微尺有一特制的玻片，中央圆圈内有一1mm长分为100个等距小格的刻线，每一小格即10μm。
目镜测微尺 物镜测微尺显微测微尺测量方法：首先须算出目镜测微尺的每一格在不同倍物镜下各为多少μm即取下接目镜卸下透镜，装上目镜测微尺然后将物镜测微尺放在镜台中央，眼观目镜，调好焦距，使两种测微尺上的刻度平行并重叠在一起按下面公式计算出目镜测微尺每格的实际长度目镜测微尺每格的长度（μm）＝物镜测微尺的格数 / 目镜测微尺的格数×10计算出目镜测微尺每格的实际长度后，再在镜台上放上需要测量的物体标本或玻片标本，即可用目镜测微尺测出它们的长度五、显微结构图的绘制技巧生物绘图是科学记录的一种方法绘图时应注意：（1）绘科学图以精确为主，不能艺术加工渲染2）只在纸的一面绘图绘图时要用2H以上绘图铅笔，纸面力求整洁3）绘图大小适宜，布局合理一般要求图画在纸的稍偏左侧，留出图注的位置4）图的各部分的位置和比例，应与显微镜中实际观察的一致，而要注意突出显微结构的每个特征5）显微构造图的点线不要重复描绘以实线表示轮廓，虚线表示被遮蔽但需表现的轮廓，用圆点的疏密来表示明暗、凹凸等层次点点时笔尖直立点的大小、疏密要均匀、整齐、浑圆6）绘图时，一般先草拟轮廓图，经检查无误后，再以准确、清晰的线作最后的描绘。
第二节 物理学和化学分析技术【知识概要】－、分离技术分离技术主要是利用物理学和化学的原理建立起来的各种分离、纯化方法常用的分离技术有以下几种：1．纸层析法层析技术是从一个混合物中分离和纯化一种或几种生物化合物的最简便的方法，用滤纸为支持物的层析法，叫纸层析法纸层析用的展层溶剂大多由水和有机溶剂组成滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，水是静止相，纸是静止相的支持物，有机溶剂是流动相，它沿着滤纸流动若将生物样品（提取液）点在滤纸上（此点称为原点）进行展层，样品中的各种溶质（如叶绿体中的四种色素，各种氨基酸等）即在两相溶剂中不断进行分配由于它们的分配系数不同，不同溶质随流动相移动的速率不等，于是就将这些溶质分离开来，形成距原点不等的层析点纸层析的具体方法：（1）制样将样品经研磨、过滤制备成提取液；（2）制备滤纸条将滤纸剪成长10cm、宽1cm的纸条在一端用铅笔画一横线（点样线）；（3）点样用毛细吸管将滤液沿点样线画一直的滤液细线；（4）层析：将层析液（石油醚、丙酮、苯的混合液）倒入烧杯，然后将滤纸条靠烧杯内壁轻轻插入层析液中5）结果几分钟后，出现层析现象2．电泳法电泳技术主要是根据不同物质所带的电荷的数量和性质不同，因而在电场移动中的速度和方向就不同。
生物分子如氨基酸、多肽、蛋白质、酶和核酸等都具有可电离的集团，在溶剂中能形成带电荷的分子，由于在不同的溶剂介质中所带的电荷的数量和性质的差别，在电场中泳动的速度（迁移率）不同，由此可以分离各种物质成分电泳的方法很多，有纸电泳、琼脂平板电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等，其中较简单的是纸上电泳法，它是用滤纸作为电泳载体的一种电泳方法纸上电泳一般操作过程（以分离血清蛋白为例）：（1）仪器准备电泳设备主要是电泳仪和电泳槽（见下图）电泳槽是供两极电泳分离和盛装缓冲液之用电泳仪提供可控电源一般采用电压在100～500V，电流在0mA～50mA或100mA2）配制缓冲液缓冲液的种类很多，可用0.5M、pH5.6巴比妥缓冲液或 Ph8.6硼酸缓冲液缓冲液配好后直接加入两侧电泳槽中3）裁剪滤纸取电泳滤纸，按2×20cm剪裁，于一端约1/3处用铅笔划点样线，将纸用缓冲液浸湿4）点样在点样线上，用50μL微量注射器点样，一般为10mL点样后，将滤纸放在电泳槽两极隔板上，两端浸入缓冲液中5）电泳接上电源，按滤纸长和宽选用电压（8V／cm）和电流（0.4mA／cm），以点样线一侧为负极，向正极泳行6）烘干取下电泳纸条在烤箱（90℃～105℃）迅速烘干。
7）染色将烘干滤纸条浸入溴酚兰染液10min，取出以0.5％醋酸溶液脱色，逐渐显出电泳带8）比色将各条区带滤纸剪下，以电泳空白滤纸为对照，在分光光比色计上比色9）计算按光密度值计算出各部分蛋白质的百分数水平电泳槽装置3．离心法离心法是一种利用物质在溶液中的密度、大小和形状的不同，以及它们沉降系数、质量、浮力因子等方面的差别，通过强离心力的作用使其分离、浓缩、提纯的技术，并可用于分子量的测定在生物学研究中，常用离心方法从组织匀浆中分离各种细胞器及各种蛋白质、核酸等生物大分子离心的设备主要是离心机，它是利用离心力对混合液进行分离和沉淀的专门仪器离心机的种类很多，有低速离心机（4000γ/ min以下）、高速离心机（4000γ/ min以上，20000γ/ min以下）和超速高心机（20000γ/ min以上）离心分离方法很多，常用的是差速离心机，是指低速和高速离心交替进行，用不同强度的离心力使不同质量的物质分批分离的方法例如，利用离心机的不同转数（rpm，即γ/ min）和时间，从鼠肝匀浆中分离各种亚细胞组分的过程（下图）：大白鼠肝脏匀装分级分离各种亚细胞组分图解二、测定技术1．定性测定——比色法。