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1、实验二常春藤叶绿体提取及ATP酶活性测定扌商要：本试验以常春藤片为实验材料，釆用差速离心将叶绿体分离并提取。H+-ATP酶活性是根据单位时间内，单位蛋白中ATP酶水解ATP产生的Pi的量来 测定和计算的。试验结果表明，常青藤叶片的叶绿体被提取后测得叶绿素含量在 正常值内，叶片中的ATP酶活性测定得到处理组与对照组达到极显著差异水平， ATP酶对植物生理生化反应存在重要作用。关键词：叶绿体；H+-ATP酶；酶活性前言：叶绿体是植物细胞中由双层膜圉成，含有叶绿素能进行光合作用的细胞 器。组织中叶绿体的含量多少，能够间接的反应植物在这一段时间内的光合作用 强度，ATP是三磷酸腺昔，ATP的分子式可以
2、简写成A-PPP,简式中的A代 表腺昔，P代表磷酸基团，代表一种特殊的化学键，叫做高能磷酸键。ATP 的水解实际上是指ATP分子中高能磷酸键的水解。高能磷酸键水解时能够释放出 大量的能量，ATP分子中大量的化学能就储存在高能磷酸键中。试验中通过测量 ATP水解出来的P+,通过这种循环往复的电子传递实现了光能向化学能的转化， 在这一过程中叶绿体起到了至关重要的作用。1试验材料与方法1. 1试验材料生长状况良好的常春藤叶片，离心机、水浴锅、分光光度计、烧杯、容量瓶、 试管、移液枪、铝纸、蒸饰水等、STN、缓冲液、无机磷标准液、3厂C水浴锅、 照光设备（光源50000Lx）、台式低温冷冻离心机（配套
3、的离心管）及冰箱、研 钵、移液枪全套、小漏斗、容量瓶（500ml、100ml）等。1.1.1试剂Tris-HCl 缓冲液 lmol/L （pH8. 0）：称 60. 57g Tris 溶于 400ml 蒸馅水中,用浓 盐酸调至PH8.0,再加蒸懈水至500ml o 10%硫酸钳酸钱溶液：称10g鋁酸镀溶 于100ml5mol/L硫酸中5mol/L硫酸溶液：取27. 8ml （比重1. 84）浓硫酸，慢 慢加入到70ml蒸饰水中，冷却后定容至100mlSTN 缓冲液,将 0. 05mol/L Tris-HClpH7. 8 缓冲液（内 0. 4mol/L 蔗糖、0. Olmol/LNaCl）放入冰
4、箱中预冷。硫酸亚铁一钮酸镀试剂：称14.285硫酸亚 铁，加入7. 14ml硫酸钮酸钱，再加蒸饰水稀释到100ml,直至溶解为止（由于 亚铁极易被氧化，因此要先配现用）1.1.2材料及预处理：取新鲜的干净常春堂叶于光照培养箱（光照22C）处理30min,随后移入冰箱冷处理lOmin,待用。1.2试验设计：叶绿体的提取和IT-ATP酶活性的测定试验分别设定三组，每组两 个处理，一个对照。1.3试验方法1.3.1叶绿体的提取摘取2-3g植物叶片，去叶脉后用自來水洗净，再用蒸镉水洗2次。叶片与 研钵均在0-4C冰箱中放置lh预冷。将预冷后的叶片剪碎加入少量石英砂和 lOmlSTN缓冲液快速磨成匀浆，
5、然后再加入2倍量的制备液，磨成匀浆后立即用 四层纱布过滤，滤液移至离心管。4C下200转离心lmin,将上清液收集在另一 离心管中，用1500转离心5min,倾去上清液即得到叶绿体沉淀。加入少量STN 缓冲制备液待用。1.3.2 H-ATP酶活性的测定无机磷标准曲线的绘制：取6支试管分别编号l-6o分别加入无机磷标准液 0, 0. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 8, 1. 0ml 和蒸镉水 1, 0. 8, 0. 6, 0. 4, 0. 2, 0 ml,再加入 0. 5ml 终止液和1ml显色液。混匀后在655nm处测定吸光值，绘制吸光值-无机磷含量 标准曲线。H+-ATP酶活性测定：取
6、制备好的叶绿体悬浮液2nd,加入2nd激活液，在室 温下500001X光照激活6mino取三支试管分别加入激活后的叶绿体溶液lml,其 中两个反应管加入lml反应液，另一管加入lml蒸饰水做对照。将三支试管置于 37C水浴中lOmin,分别加入0. 5m 1终止液和lml显色液离心后取上清液在655nm 处比色，通过对照无机磷标曲获得酶活性。叶绿素含量(mg/ml)=A652X1.45mg/ml (A652652nm 处的吸光值)2结果与分析2.1叶绿素含童的测定经试验测定和计算，常青藤叶片的的叶绿素含量如表1所示。表1常青藤叶片叶绿素含量Table 1. The content of chl
7、orophyll in ivy leaves.第一组第二组第三组叶重(g)2. 68592. 1862. 3954叶绿素含量 (mg/ml)0. 77140. 48140. 6426由表1可以看出，试验中叶绿素含量值在0. 4-0. 8 mg/m 1的正常范圉内，可以在此基 础上进行ATP酶活性值得测定试验，绘制吸光值-无机磷含量标准曲线。2.2无机磷标准曲线制作00. 20.40. 60. 81A值00. 5370. 9921. 3351. 8512. 146甞爲无机磷标准曲线无机磷标准曲线为：Y=2. 145X+0. 071R2二0.99392. 3激活后的叶绿体溶液在655nm处比色结果
8、及所求无机磷含量表2组数第一组第二组第三组吸光值0. 4110. 7490. 856无机磷含量（ml）0. 15850. 31610. 3660在实验中常常用单位时间单位质量无机磷物质的量的多少来间接反映ATP 酶活性的高低，所以通过测定无机磷的的含量，來确定ATP酶的活性，为实际的 农业生产提供理论指导。按以下公式计算ATP活性：ATP酶活性（umolPimgT叶绿素hT ） =umolPi X川户；含井X丰其中：umolPi为所测得常春藤的吸光值所对应的的标曲上的无机磷含量；V为反 应体积；VI为取样体积，t为反应的时间（min）表3 ATP酶活性指数的测定数据表组数第一组第二组第三组AT
9、P 酶活性(umol. (mg. h) 一 1)246787683讨论：ATP酶的活性与光合磷酸化活性的关系非常密切，如果ATP酶活性下降, 则光合磷酸化活性下降，叶片中ATP含量减少，这样势必影响到叶片的光合作用 速 率。可见ATP酶活性与光合作用的关系是紧密相连的。叶绿体将光能转化为 活跃的化学能，并贮存在ATP中,产生的ATP的数量就越多，为光合作用的暗 反应提供的“同化力”就越多，有利于光合作用C02的固定和同化，产生较多 的光合产物，从而其光合效率高。标准曲线是指通过测定一系列己知组分的标准物质的某理化性质，而得到的 性质的数值曲线。标准曲线是标准物质的物理/化学属性跟仪器响应之间的
10、函数 关系。建立标准輕L的目的是推导待测物质的理化属性。在分析化学实验中,常 用标准曲线法进行定量分析,通常情况下的标准工作曲线是一条直线。与校正曲 线不同，它是以标准溶液及介质组成的标准系列，标绘出來的曲线。校正曲线的 标准系列的伴生组分必须与试样相匹配，以便测量结果的准确。只有标准曲线与 校正曲线相重合的条件下，才可以用标准曲线來代替校正曲线.标准曲线具有重 要的应用性和现有方法趋向于标准堕线适用于较宽的样品浓度范围。在较宽的浓 度跨度和有限的标准点的情况下,均匀的分布浓度点是最佳选择，这样对该标准 虫线覆盖的浓度范围内，对于所有的浓度所提供的信息量都是相同的。奇数点的 设置來源于我们的信
11、息，我们总是先知道浓度的范围，在该浓度范围先确定中间 点，然后在中间点左右分布对称的标准堕线点，所以出來的总是奇数个点。正如 前面强调的是，点多点少，最后影响的是标准堕线所查出样品理化属性的不确定 度，到底多大的不确定度是符合要求呢，这就是你在判断样品的结果是否超标或 符合限侑的时偉有重要音义c设置空白并照的管矗目的是：为了减少系统误差。用空白管调整零位时，仪 器和试剂等造成的系统误差就可以抵消或减小到最低程度。在很多试验中都是这 样做，或者以标准试样做空白试验，就是为了降低系统误差。如何保证所有试管在反应lOmin后精准地停止反应？其实很简单在开始做 反应实验前。看好时间每隔2-3分钟放入一
12、个试管。这样就有了中间加反应液 的时间，和取出试管的时间，更好的把握反应时间的准确性。ATP酶的激活方法有3种，分别为Mg2+-ATP酶激活液激活、Ca2+-ATP酶激 活液激活和热处理激活。Mg2+-ATP酶激活液激活的方式为，取制备好的叶绿素 悬浮液1ml,加入lml激活液，与室温在白炽光5OOOO1X下进行激活6min。 Ca2+-ATP酶激活液激活的方式为，取制备好的叶绿素悬浮液lml,加入lml激活 液，置于2OC水浴中保温激活lOmin,加入牛血清蛋白0. lml停止激活；热处理 激活的方式为，取制备好的叶绿素悬浮液Im含Tris-HCL20mmol/LDTT5mmol/I ATP 20mmol/L的激活液中，置于64C水浴中保温4min,与自来水中冷却。参考文献李良璧，张正东譚克辉，周佩珍,周嘉运 植物叶绿体互补作用的研究一一 I .杂交双亲叶绿 体的互补作用卩遗传学报,1978,03:196-203.2张志良，瞿伟菁.植物生理学实验指导M.第3版.北京:高等教育出版社,2003:67-70.王忠.植物生理学M.北京：中国农业出版12000:147-148466-168.4徐人全，沈允纲.光合产物与光合机构运输关系的探讨.植物生理学报,1982,8:173.
