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1、蛋白表达及纯化策略一. 目录:含组氨酸标签的蛋白诱导表达及纯化GST-融合蛋白的纯白化策略DEAE 纯化蛋白策略分子筛纯化蛋白策略二. 试剂:所用试剂均购自上海生工三. 资料来源:汪德强老师四. 撰写:罗淼 牛司强含组氨酸标签的蛋白的诱导表达及纯化.用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因所需特殊试剂:IM IPTG1. 将目的基因与 IPTG 诱导表达载体连接,构成重组质粒并转化相应的表达用的大肠杆菌。将转化体铺于含相应抗生素的LB平板,37 V培养 过夜。通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。2. 分别挑取对照菌和重组菌1个菌落,接种于1ml含有相应抗生素的LB 培养液中,37
2、C通气培养过夜。3. 取 1 00微升过夜培养物接种于 5ml 含有相应抗生素的 LB 培养液中(各 10份),适当的温度(20-37C)震荡培养4小时,至对数中期(A550=0.1-1.0 )。4. 对照菌和重组菌各取 1ml 未经诱导的培养物于离心管中,剩余培养物中加入 IPTG 至终浓度分别为 0.5, 1.0, 1.5, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5,5.0mM 相同的温度继续通气培养。5. 在诱导的1, 2, 3, 4, 5个小时取1ml样品于Ep管中。细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达,因此必须对接种菌量,诱导前细菌生长时间和诱导后细菌密度进行控制。生长过度或过
3、速会加重细菌合成系统的负担,导致包涵体的形成。生长温度可能是影响大肠杆菌高度表达目的蛋白的最重要因素。低温培养能在一定程度上抑制包涵体的形成。IPTG的浓度对表达水平的影响也非常大。所以通过试验确定最佳的培养条件是很必要的。6. 将所有样本室温最高速度离心1分钟,弃上清,沉淀重悬于100微升1XSDS蛋白上样缓冲液中,100C加热5分钟,室温最高速度离心1 分钟,取 15 微升样品上样于 SDS 聚丙烯酰胺凝胶,用 SDSPAGE 观察表达产物条带,从而确定优化的培养条件。二. 大量表达靶蛋白1. 取保存的重组大肠杆菌菌液 150 微升接种于 30 毫升含相应抗生素的LB培养液中,在100毫升
4、锥形瓶中,300rpm, 37C通气过夜培养。2. 取16毫升过夜培养物接种于800ml含相应抗生素的LB培养液,在2L 的锥形瓶中用预实验所确定的最佳诱导温度,300rpm,通气培养4小 时,至对数生长中期。3. 以预实验确定的最佳 IPTG 浓度,最佳时间和最佳温度诱导表达靶蛋白。4. 收集菌液,4C, 5000g (5500rpm)离心15分钟收集沉淀,一70C保 存。三. 细菌破碎和蛋白质溶解所需特殊试剂:非变性裂解液:50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl ,10 mM 咪唑,pH8.0超声破碎液: 50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl , pH8.01.
5、每 200ml 菌液离心所得沉淀以 10ml 非变性裂解液充分重悬,同时加 入蛋白酶抑制剂 PMSF 至终浓度 1mM。2. 超声破碎细菌,功率选择在稍低于溶液产生泡沫的水平。工作时间 5 秒,间隙时间5秒,总时间20分钟(破碎时间一般不宜超过 10分钟 菌量不超过lg)。整个超声过程中探头离烧杯底部1厘米为佳,烧杯 置于冰浴中。3. 超声破碎后,取1 滴菌液于载玻片上,烤干后用结晶紫染色观察超声 破碎是否完全,大肠杆菌是否被破碎成球状或球杆状。破碎不完全可 适当延长超声破碎时间。4. 将细菌破碎液以lOOOOrpm, 30分钟,4C离心,收集上清。用等同于 上清体积的超声破碎液重悬沉淀。5.
6、 分别取10微升上清和沉淀重悬液用于SDS-PAGE检测,以确定是包 涵体表达还是上清表达。其余置于一70C保存四. Ni-NTA亲和纯化带组氨酸标签蛋白的纯化策略一)若为上清表达所需特殊试剂:非变性裂解液:50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl ,10 mM 咪唑,pH8.0Wash buffer: 50mM NaH2PO4,300 mM Nacl ,20 mM 咪唑,pH8.0 Elution buffer: 50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl ,250mM 咪唑,pH8.01. 离心后上清蛋白与Ni-NTA混匀,冰水浴中于脱色摆床上轻摇1小时, 使之充分混匀结
7、合。为了完全去除杂质,离心两次或离心后用 0.4 微米 微孔滤膜过滤。2. 将混合物转移至层析柱中,让液体自然流出,速度可稍慢(5 一 6秒/滴) , 收集流出液体。可以取样进行SDS-PAGE,看蛋白挂柱情况。3. 用 Wash buffer 洗涤层析柱,洗涤量约为胶体积的50一100倍,以便充分洗去杂蛋白。为了洗的更彻底,可以把胶混悬后再让液体流出,中间 可以重复数次。因为胶板结之后,洗涤效果可能会差些。4. 用 Elution buffer 洗柱,用 1.5mLEP 管收集洗脱液,直至 A2800.1。5测定收集的洗涤液和洗脱液的A280,选择A280变化明显的管取样进行 SDS-PAG
8、E分析组氨酸标签蛋白的分布。根据A28o和电泳图选择合并 a280相近的管,弃掉没有目的蛋白的管。目的蛋白的脱盐处理可以用透 析,也可以超滤,还可以过分子筛。如果需要更大的蛋白浓度,可以使 用超滤的办法。收集的蛋白-20C保存。说明:只经过Ni-NTA纯化,所得蛋白一般不纯,往往混有杂蛋白。这时可以考虑进一步的纯化措施,比如DEAE,分子筛,疏水层析等。二)若为包涵体表达所需特殊试剂:细胞裂解液:50mM Tris-Hcl ,100 mM Nacl ,0.5%Triton X-100, pH 8.0 变性裂解液:10mM NaH2PO4 ,10mM Tris-Hcl, 8M 尿素,pH8.0
9、复性液:100mM NaH2PO4,10mM Tris-Hcl 2 mM 还原型谷光甘肽, 0.2 mM氧化型谷光甘肽Wash buffer: 100mM NaH2PO4, 10mM Tris-Hcl, pH6.3Elution buffer: 100mM NaH2PO4, 10mM Tris-Hcl, pH4.51. 将沉淀重悬液缓慢冻融离心,去上清,沉淀重悬于9倍体积的4C细胞裂 解液,每克菌体加入 4mg 脱氧胆酸,悬液室温放置 5 分钟, 4C, 12000rpmx15分钟。洗涤5次。2. 每克沉淀重悬于9ml含0.1 mM PMSF,10 mM 2-巯基乙醇,2 mM还原 型谷光甘肽
10、和0.2 mM氧化型谷光甘肽的变性裂解液中,调节pH在10.7, 室温放置60分钟。3. 再用盐酸调pH至8.0,室温放置30分钟。4. 4C,12000rpmx15分钟离心,留上清待用。沉淀重悬于100微升1xSDS 蛋白上样缓冲液中。取10微升上清加10微升2xSDS上样缓冲液,上 清和沉淀分别进行SDS-PAGE分析溶解程度。5. 稀释透析复性:每毫升上清缓慢加入9毫升6M尿素的复性液中。装入 经 10 mM NaOH 和 1.0 mM EDTA 煮沸 30 分钟,蒸馏水洗涤干净的透析 袋中。在4C10倍以上体积含有2M尿素的复性液中透析5个小时。6. 取出透析袋,再放入4C10倍以上体
11、积的复性液中透析过夜。7. 取出透析袋中的蛋白,测定其A280,加入相应体积的Ni-NTA树脂混匀, 按与上清纯化相同的方法上柱纯化,但是Wash buffer和Elution buffer 用包涵体纯化的 pH 递减的缓冲液。五.Ni-NTA树脂的再生(Qiagen公司)当Ni-NTA琼脂糖的颜色由浅蓝色变成灰褐色,此时Ni-NTA树脂需要再 生后才能使用。所需试剂:再生缓冲液:6M盐酸胍+ 0.2M乙酸2SDS(m/V)25%, 30%, 50%, 75% 的乙醇(V/V)100mM EDTA,pH8.0100mM NiSO4裂解缓冲液 A:10mM NaH2PO4 +10mM Tris-
12、Hcl +6M 盐酸胍,pH8.0裂解缓冲液 B:10mM NaH2PO4 +10mM Tris-Hcl +8M尿素,pH8.0步骤如下:1. 用下列试剂依次彻底冲洗层析柱:2 倍柱体积的再生缓冲液5 倍柱体积的双蒸水3 倍柱体积的 2% SDS1 倍柱体积的 25%的乙醇1 倍柱体积的 50%的乙醇1 倍柱体积的 75%的乙醇5 倍柱体积的 100%的乙醇1 倍柱体积的 75 的乙醇1 倍柱体积的 50 的乙醇1 倍柱体积的 25 的乙醇1 倍柱体积的双蒸水5 倍柱体积的 100mM EDTA1 倍柱体积的双蒸水2 倍柱体积的 100mM NiSO42 倍柱体积的双蒸水2 倍柱体积的再生缓冲
13、液2. 2倍柱体积的适当的裂解缓冲液(A或B)平衡Ni-NTA树脂3. 将再生后的Ni-NTA树脂按1:1的比例保存在30%的乙醇中GST-融合蛋白的纯化策略所需特殊试剂:PBS :140mM Nacl ,2.7mM Kcl ,10mM Na2HPO4, 1 .8mM KH2PO4Elution buffer : 10 mM Glutathione ,50mM Tris-Hcl,pH8.01. 离心后上清加入预先用 PBS 平衡的 400 微升 Glutathione-Sepharose-4B, 冰水浴中于脱色摆床上轻摇 1 小时,使之充分混匀结合。2. 将混合物转移至层析柱中,让液体自然流出
14、,速度可稍慢(56 秒/滴), 收集流出液体。可以取样进行SDS-PAGE看蛋白挂柱情况。3. 用PBS洗涤层析柱,洗涤量约为胶体积的50-100倍,以便充分洗去杂蛋白。为了洗的更彻底,可以把胶混悬后再让液体流出,中间可以重复 数次。因为胶板结之后,洗涤效果可能会差些。4. 用Elution buffer洗柱,用1.5mLEP管收集洗脱液,直至A2800.1O若蛋 白需求量大,为了洗脱的更干净,可以加大洗脱的体积(如 100 毫升), 这时可以用烧杯收集。5. 测定收集的洗涤液和洗脱液的A280,选择A280变化明显的管取样进行 SDS-PAGE,分析目的蛋白的分布。根据A280和电泳图选择合
15、并A280相 近的管,弃掉没有目的蛋白的管。目的蛋白的脱盐处理可以用透析,也 可以超滤,还可以过分子筛。如果需要更大的蛋白浓度,可以使用超滤 的办法。收集的蛋白-20 C保存。说明:只经过 GST 纯化,所得蛋白一般不纯,往往混有杂蛋白。这时可以 考虑进一步的纯化措施,比如DEAE,分子筛,疏水层析等。DEAE 纯化蛋白策略1. 平衡。在纯化之前,确保离子交换胶床已被平衡。通常用pH8.0的20mM Tris-Hcl冲洗柱子3-5个柱体积,冲洗速度可以适当快些,比如30-50 毫升/小时,直至达到平衡。缓冲液pH要求高于目的蛋白等电点2个左右 pH单位。如果某一目的蛋白的等电点为6.5,这时选择pH8.5的20mM Tris-Hcl缓冲液更为合适。2. 上样。要求蛋白样品的离子浓度最好低于15 mM,缓冲液pH高于目的蛋白等电点2个左右pH单位,缓慢上样,便于目的蛋白更好的和胶结合。打开蛋白检测系统,在层析图谱上观察上样情况。上样完毕后,用pH8.0 的20mM Tris-Hcl冲洗柱子2-3个柱体积,在层析图谱上表现为回到基线位置。上样后的穿过液取样电泳,分析目的蛋白的挂柱情况。同时保存好 穿过液,以备挂不上柱子可以再利用。3. 洗脱。选择合适的