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1、蛋白表达及纯化策略一. 目录：含组氨酸标签的蛋白诱导表达及纯化GST-融合蛋白的纯白化策略DEAE 纯化蛋白策略分子筛纯化蛋白策略二. 试剂：所用试剂均购自上海生工三. 资料来源：汪德强老师四. 撰写：罗淼 牛司强含组氨酸标签的蛋白的诱导表达及纯化.用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因所需特殊试剂：IM IPTG1. 将目的基因与 IPTG 诱导表达载体连接，构成重组质粒并转化相应的表达用的大肠杆菌。将转化体铺于含相应抗生素的LB平板，37 V培养 过夜。通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。2. 分别挑取对照菌和重组菌1个菌落，接种于1ml含有相应抗生素的LB 培养液中，37
2、C通气培养过夜。3. 取 1 00微升过夜培养物接种于 5ml 含有相应抗生素的 LB 培养液中（各 10份），适当的温度（20-37C）震荡培养4小时，至对数中期（A550=0.1-1.0 )。4. 对照菌和重组菌各取 1ml 未经诱导的培养物于离心管中，剩余培养物中加入 IPTG 至终浓度分别为 0.5, 1.0, 1.5, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5,5.0mM 相同的温度继续通气培养。5. 在诱导的1, 2, 3, 4, 5个小时取1ml样品于Ep管中。细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达,因此必须对接种菌量,诱导前细菌生长时间和诱导后细菌密度进行控制。生长过度或过
3、速会加重细菌合成系统的负担,导致包涵体的形成。生长温度可能是影响大肠杆菌高度表达目的蛋白的最重要因素。低温培养能在一定程度上抑制包涵体的形成。IPTG的浓度对表达水平的影响也非常大。所以通过试验确定最佳的培养条件是很必要的。6. 将所有样本室温最高速度离心1分钟,弃上清,沉淀重悬于100微升1XSDS蛋白上样缓冲液中，100C加热5分钟，室温最高速度离心1 分钟,取 15 微升样品上样于 SDS 聚丙烯酰胺凝胶,用 SDSPAGE 观察表达产物条带,从而确定优化的培养条件。二. 大量表达靶蛋白1. 取保存的重组大肠杆菌菌液 150 微升接种于 30 毫升含相应抗生素的LB培养液中，在100毫升
4、锥形瓶中，300rpm, 37C通气过夜培养。2. 取16毫升过夜培养物接种于800ml含相应抗生素的LB培养液，在2L 的锥形瓶中用预实验所确定的最佳诱导温度，300rpm，通气培养4小 时,至对数生长中期。3. 以预实验确定的最佳 IPTG 浓度,最佳时间和最佳温度诱导表达靶蛋白。4. 收集菌液，4C, 5000g (5500rpm)离心15分钟收集沉淀，一70C保 存。三. 细菌破碎和蛋白质溶解所需特殊试剂：非变性裂解液：50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl ,10 mM 咪唑，pH8.0超声破碎液： 50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl , pH8.01.
5、每 200ml 菌液离心所得沉淀以 10ml 非变性裂解液充分重悬，同时加 入蛋白酶抑制剂 PMSF 至终浓度 1mM。2. 超声破碎细菌，功率选择在稍低于溶液产生泡沫的水平。工作时间 5 秒，间隙时间5秒，总时间20分钟（破碎时间一般不宜超过 10分钟 菌量不超过lg）。整个超声过程中探头离烧杯底部1厘米为佳，烧杯 置于冰浴中。3. 超声破碎后，取1 滴菌液于载玻片上，烤干后用结晶紫染色观察超声 破碎是否完全，大肠杆菌是否被破碎成球状或球杆状。破碎不完全可 适当延长超声破碎时间。4. 将细菌破碎液以lOOOOrpm, 30分钟，4C离心，收集上清。用等同于 上清体积的超声破碎液重悬沉淀。5.
6、 分别取10微升上清和沉淀重悬液用于SDS-PAGE检测，以确定是包 涵体表达还是上清表达。其余置于一70C保存四. Ni-NTA亲和纯化带组氨酸标签蛋白的纯化策略一）若为上清表达所需特殊试剂：非变性裂解液：50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl ,10 mM 咪唑，pH8.0Wash buffer: 50mM NaH2PO4,300 mM Nacl ,20 mM 咪唑，pH8.0 Elution buffer: 50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl ,250mM 咪唑，pH8.01. 离心后上清蛋白与Ni-NTA混匀，冰水浴中于脱色摆床上轻摇1小时， 使之充分混匀结
7、合。为了完全去除杂质，离心两次或离心后用 0.4 微米 微孔滤膜过滤。2. 将混合物转移至层析柱中，让液体自然流出，速度可稍慢（5 一 6秒/滴） ， 收集流出液体。可以取样进行SDS-PAGE,看蛋白挂柱情况。3. 用 Wash buffer 洗涤层析柱，洗涤量约为胶体积的50一100倍，以便充分洗去杂蛋白。为了洗的更彻底，可以把胶混悬后再让液体流出，中间 可以重复数次。因为胶板结之后，洗涤效果可能会差些。4. 用 Elution buffer 洗柱，用 1.5mLEP 管收集洗脱液，直至 A2800.1。5测定收集的洗涤液和洗脱液的A280，选择A280变化明显的管取样进行 SDS-PAG
8、E分析组氨酸标签蛋白的分布。根据A28o和电泳图选择合并 a280相近的管，弃掉没有目的蛋白的管。目的蛋白的脱盐处理可以用透 析，也可以超滤，还可以过分子筛。如果需要更大的蛋白浓度，可以使 用超滤的办法。收集的蛋白-20C保存。说明：只经过Ni-NTA纯化，所得蛋白一般不纯，往往混有杂蛋白。这时可以考虑进一步的纯化措施，比如DEAE，分子筛，疏水层析等。二）若为包涵体表达所需特殊试剂：细胞裂解液：50mM Tris-Hcl ,100 mM Nacl ,0.5%Triton X-100, pH 8.0 变性裂解液：10mM NaH2PO4 ,10mM Tris-Hcl, 8M 尿素，pH8.0
9、复性液：100mM NaH2PO4，10mM Tris-Hcl 2 mM 还原型谷光甘肽， 0.2 mM氧化型谷光甘肽Wash buffer: 100mM NaH2PO4， 10mM Tris-Hcl， pH6.3Elution buffer: 100mM NaH2PO4， 10mM Tris-Hcl， pH4.51. 将沉淀重悬液缓慢冻融离心，去上清，沉淀重悬于9倍体积的4C细胞裂 解液，每克菌体加入 4mg 脱氧胆酸，悬液室温放置 5 分钟， 4C， 12000rpmx15分钟。洗涤5次。2. 每克沉淀重悬于9ml含0.1 mM PMSF，10 mM 2-巯基乙醇，2 mM还原 型谷光甘肽
10、和0.2 mM氧化型谷光甘肽的变性裂解液中，调节pH在10.7, 室温放置60分钟。3. 再用盐酸调pH至8.0，室温放置30分钟。4. 4C，12000rpmx15分钟离心，留上清待用。沉淀重悬于100微升1xSDS 蛋白上样缓冲液中。取10微升上清加10微升2xSDS上样缓冲液，上 清和沉淀分别进行SDS-PAGE分析溶解程度。5. 稀释透析复性：每毫升上清缓慢加入9毫升6M尿素的复性液中。装入 经 10 mM NaOH 和 1.0 mM EDTA 煮沸 30 分钟，蒸馏水洗涤干净的透析 袋中。在4C10倍以上体积含有2M尿素的复性液中透析5个小时。6. 取出透析袋，再放入4C10倍以上体
11、积的复性液中透析过夜。7. 取出透析袋中的蛋白，测定其A280，加入相应体积的Ni-NTA树脂混匀, 按与上清纯化相同的方法上柱纯化，但是Wash buffer和Elution buffer 用包涵体纯化的 pH 递减的缓冲液。五.Ni-NTA树脂的再生（Qiagen公司）当Ni-NTA琼脂糖的颜色由浅蓝色变成灰褐色，此时Ni-NTA树脂需要再 生后才能使用。所需试剂：再生缓冲液：6M盐酸胍+ 0.2M乙酸2SDS（m/V）25%, 30%, 50%, 75% 的乙醇（V/V）100mM EDTA,pH8.0100mM NiSO4裂解缓冲液 A：10mM NaH2PO4 +10mM Tris-
12、Hcl +6M 盐酸胍,pH8.0裂解缓冲液 B：10mM NaH2PO4 +10mM Tris-Hcl +8M尿素，pH8.0步骤如下：1. 用下列试剂依次彻底冲洗层析柱：2 倍柱体积的再生缓冲液5 倍柱体积的双蒸水3 倍柱体积的 2% SDS1 倍柱体积的 25%的乙醇1 倍柱体积的 50%的乙醇1 倍柱体积的 75%的乙醇5 倍柱体积的 100%的乙醇1 倍柱体积的 75 的乙醇1 倍柱体积的 50 的乙醇1 倍柱体积的 25 的乙醇1 倍柱体积的双蒸水5 倍柱体积的 100mM EDTA1 倍柱体积的双蒸水2 倍柱体积的 100mM NiSO42 倍柱体积的双蒸水2 倍柱体积的再生缓冲
13、液2. 2倍柱体积的适当的裂解缓冲液（A或B）平衡Ni-NTA树脂3. 将再生后的Ni-NTA树脂按1：1的比例保存在30%的乙醇中GST-融合蛋白的纯化策略所需特殊试剂：PBS :140mM Nacl ,2.7mM Kcl ,10mM Na2HPO4, 1 .8mM KH2PO4Elution buffer : 10 mM Glutathione ,50mM Tris-Hcl，pH8.01. 离心后上清加入预先用 PBS 平衡的 400 微升 Glutathione-Sepharose-4B， 冰水浴中于脱色摆床上轻摇 1 小时，使之充分混匀结合。2. 将混合物转移至层析柱中，让液体自然流出
14、，速度可稍慢（56 秒/滴）， 收集流出液体。可以取样进行SDS-PAGE看蛋白挂柱情况。3. 用PBS洗涤层析柱，洗涤量约为胶体积的50-100倍，以便充分洗去杂蛋白。为了洗的更彻底，可以把胶混悬后再让液体流出，中间可以重复 数次。因为胶板结之后，洗涤效果可能会差些。4. 用Elution buffer洗柱，用1.5mLEP管收集洗脱液，直至A2800.1O若蛋 白需求量大，为了洗脱的更干净，可以加大洗脱的体积（如 100 毫升）， 这时可以用烧杯收集。5. 测定收集的洗涤液和洗脱液的A280，选择A280变化明显的管取样进行 SDS-PAGE,分析目的蛋白的分布。根据A280和电泳图选择合
15、并A280相 近的管，弃掉没有目的蛋白的管。目的蛋白的脱盐处理可以用透析，也 可以超滤，还可以过分子筛。如果需要更大的蛋白浓度，可以使用超滤 的办法。收集的蛋白-20 C保存。说明：只经过 GST 纯化，所得蛋白一般不纯，往往混有杂蛋白。这时可以 考虑进一步的纯化措施，比如DEAE,分子筛，疏水层析等。DEAE 纯化蛋白策略1. 平衡。在纯化之前，确保离子交换胶床已被平衡。通常用pH8.0的20mM Tris-Hcl冲洗柱子3-5个柱体积，冲洗速度可以适当快些，比如30-50 毫升/小时，直至达到平衡。缓冲液pH要求高于目的蛋白等电点2个左右 pH单位。如果某一目的蛋白的等电点为6.5,这时选择pH8.5的20mM Tris-Hcl缓冲液更为合适。2. 上样。要求蛋白样品的离子浓度最好低于15 mM,缓冲液pH高于目的蛋白等电点2个左右pH单位，缓慢上样，便于目的蛋白更好的和胶结合。打开蛋白检测系统，在层析图谱上观察上样情况。上样完毕后，用pH8.0 的20mM Tris-Hcl冲洗柱子2-3个柱体积，在层析图谱上表现为回到基线位置。上样后的穿过液取样电泳，分析目的蛋白的挂柱情况。同时保存好 穿过液，以备挂不上柱子可以再利用。3. 洗脱。选择合适的
