高考揭秘从3年高考试题来看，高考命题思路常以某一生产生活或医学治疗为背景，内容考察内容几乎都与基因工程相关，也就是是说，即便主体是考察微生物培养，它仍然能够涉及微生物的转基因，所以我们这一块的复习一定要紧紧围绕基因工程，在复习中从以下几方面内容发力，还需多做新情景，将会收到良好的效果PCR为目的基因提供酶切位点等内容相对困难，需要做全方位梳理 基因工程难度大，需要多练限制酶选择，正反接检测和基因编辑等情景 微生物的选择和鉴别是核心考点，结合基因工程改造近几年命题趋势 细胞工程和胚胎工程：常以中国最新的技术为背景考察热点考察：新冠检测相关技术，酵母双杂等复杂情景(题目主要来源：2019-2022年山东、湖南、湖北、河北、北京、广东卷)专题五：结合科学前沿的生物科学技术专题第2讲：基因工程的高频考点与情景考法1 基因工程的核心内容考法2 限制酶的选择（高频）考法3 正反接的检测方式（难点）考法4 基因编辑（反义基因、课本CRISRP/Cas9）专题五：结合科学前沿的生物科学技术专题1.基因工程中的4个“3”基因工程的3种基本工具 限制酶：识别特定核苷酸序列，并在特定位点上切割DNA分子注意：不是只识别一种序列，有些可以识别摇摆的序列 DNA连接酶：EcoliDNA连接酶只能连接黏性末端；T4DNA连接酶能连接黏性末端和平末端。
载体：需具备的条件包括：a.能在宿主细胞内稳定存在并大量复制b.有一个至多个限制酶切割位点c.具有标记基因，以便对目的基因进行检测注意条件和作用得区分）考法1 基因工程的核心内容1.基因工程中的4个“3”获取目的基因的3条途径 从基因文库中获取：基因组文库：包含某生物的全部基因片段cDNA文库：不含启动子，终止子和内含子，方便进行基因工程的基因交流 利用PCR技术扩增；用化学方法直接人工合成：常用mRNA逆转录现成cDNA考法1 基因工程的核心内容1.基因工程中的4个“3”将目的基因导入受体细胞的3种类型植物：体细胞或受精卵常用农杆菌转化法(双子叶植物和裸子植物)、花粉管通道法、基因枪法(单子叶植物，老教材)动物：受精卵显微注射技术微生物：常用大肠杆菌钙离子处理法（严格按课本填，不要写感受态细胞法）考法1 基因工程的核心内容1.基因工程中的4个“3”目的基因分子水平检测的3个层次 检测目的基因是否插入到转基因生物的DNA上：PCR或DNA分子杂交技术（两个都答）检测目的基因是否转录出了mRNA：PCR或分子杂交技术检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原抗体杂交技术如果问的是原理：抗原和抗体可以特异性结合考法1 基因工程的核心内容2020山东省高三期末节选 血管内皮生长因子(VEGF)是在肿瘤细胞中通过表达，分泌到血液中的蛋白类生长因子，促进肿瘤血管的生成，进而为肿瘤组织生长提供足够的氧气和营养物质。
研究人员利用pVAX1质粒和VEGF基因构建了pVAX1VEGF的DNA疫苗，为肿瘤免疫治疗奠定基础回答下列问题：1)首先从人的肺癌细胞株A549中提取mRNA，通过_法获得VEGF基因3)构建的pVAX1VEGF上应含有特定的_(填“复制原点”“启动子”或“标记基因”)，它能被受体细胞的_所识别，以便于催化转录过程4)DNA疫苗制备简单，价格低廉，且免疫强度高，应答持久，但同时也可能存在着不可忽视的潜在危险你认为可能存在的潜在危险是_反转录启动子RNA聚合酶DNA疫苗注入体内后，可能整合到宿主基因组上，导致细胞发生变异，使细胞功能异常2.(2020河北省邯郸一中高三月考)基因工程载体是DNA重组技术使用的基本工具回答下列问题：1)大肠杆菌的质粒常被用来做基因工程中的载体，其主要优点是_(至少两项)基因工程中常使用的载体除质粒外，还有_(至少两项)2)在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行人工改造过的在构建基因表达载体时，通过人工改造，基因表达载体中除了含有目的基因外，还必须有_等构建目的基因表达载体的目的一方面是使目的基因在受体细胞中_，并遗传给下一代；另一方面，使目的基因能够_，从而得到转基因产品或生物。
能自主复制，有标记基因，有一个至多个酶切位点噬菌体、动植物病毒启动子、终止子和标记基因稳定存在表达并发挥作用2.基因工程的核心步骤：基因表达载体的构建 基因表达载体的组成：基因表达载体启动子目的基因终止子标记基因复制原点目的基因插入启动子下游，终止子上游 基本构建过程：我们会更加倾向于选择双酶切，因为可以避免质粒和目的基因的自生环化以及反向连接考法1 基因工程的核心内容2.基因工程的核心步骤：基因表达载体的构建 启动子具有物种特异性和组织特异性 例如用乳腺生物反应器生产药用蛋白的时候药用蛋白基因连接在乳腺蛋白基因的启动子后面 枯草芽孢杆菌分泌可降解纤维素的一种酶，这种酶由W基因编码为在乳酸杆菌中表达W基因，在构建基因表达载体时，W基因上游启动子应选择_（填写字母）A枯草芽孢杆菌启动子B乳酸杆菌启动子C农杆菌启动子让W基因在乳酸杆菌中成功表达，所以应当选择乳酸杆菌启动子B考法1 基因工程的核心内容典例 研究人员利用生物工程技术，探究猪bmp15基因在不同组织细胞中的特异性表达该工程技术基本流程如下图(EGFP基因控制合成增强型绿色荧光蛋白；过程表示表达载体2成功导入各组织细胞)请回答：1）过程中，需利用_限制酶处理表达载体1。
2）过程中，常采用_技术将表达载体2成功导入受体细胞Xho和Hind 显微注射3）在实验结果的基础上，提取上述猪肌肉细胞的_(填“mRNA”或“DNA”)，利用标记的_作探针，进行分子杂交，可进一步探究猪bmp15基因特异性表达的原因4）实验结果表面，猪bmp15基因在_细胞特异性表达猪卵巢mRNAEGFP基因 1.限制酶选择的基本方法 选择的限制酶的切点不能位于目的基因内部，所以上述不能选择_答案：Sma 当标记基因唯一时，也不能位于标记基因内部，否则会破坏目的基因或标记基因，上图中不能选择_答案：Sma考法2 限制酶的选择（高频）1.限制酶选择的基本方法 应选择切点位于目的基因两端的限制酶，同时质粒上也有其切点，如上图中可选择_答案：Pst 为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如上图也可选择用_两种限制酶答案：Pst和EcoR考法2 限制酶的选择（高频）2023广东校联考 为使目的基因与载体正确连接，在设计 PCR 引物时可添加限制酶 _的识别序列Xho和Mun 考察排除法：因为使用S和N会破坏目的基因，使用E会导致重组质粒两个标记基因都被破坏2.同种酶和同尾酶 及重点题型分析限制酶 BamHI Bgl Hind XbaI识别序列和切割位点GGATCCAGATCTAAGCTTTCTAGA过程需要的限制酶是_质粒需要的限制酶是_提示：双标记基因得切除一个考法2 限制酶的选择（高频）上一页的题目继续节选 研究发现人溶菌酶（hLZ）是天然抗生素替代品。
科学家培育出转人溶菌酶基因山羊，以大规模生产人溶菌酶（从乳汁中提取）过程如图所示其中编号表示过程;质粒S中的基因Len通过控制相关酶的合成而控制亮氨酸的合成（亮氨酸是山羊细胞维持生命活动必不可少的一种必需氨基酸），基因GFP控制合成绿色荧光蛋白四种限制性核酸内切酶的识别序列及切割位点见下表请回答下列问题：2）为成功筛选出含重组质粒T的成纤维细胞质粒S中用作标记基因的是_为达到筛选目的，培养基的营养成分中特殊之处是_若用PCR检测目的基因是否成功导入受体细胞中，实验组以待测的样本DNA为模板，使用目的基因的特异性引物进行PCR扩增，同时将以目的基因片段为模板的组别作为阳性对照组，将以_为模板的组别作为阴性对照组非目的基因片段或S质粒基因Leu、基因GFP(就算要被目的基因切除也算标记基因)不含有亮氨酸2022湖北节选 提取品系乙的mRNA，通过基因重组技术，以Ti质粒为表达载体，以品系甲的叶片外植体为受体，培有出转S基因的新品系3）如图是S基因的cDNA和载体的限制性内切核酸酶（限制性核酸内切酶）酶谱为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用_酶切割S基因的cDNA和载体。
Xba、Hind 考法3 正反接的检测（难点，需要绘图）补充知识点 即便我在质粒插入了目的基因，但是有时候可能根本无法表达，常见原因分析：目的基因不能正常表达（转录和翻译过程受阻）；目的基因反向连接1.利用电泳进行检测2.利用PCR进行检测后续如有其他方式再补充2022广东高三统考节选 某科研团队利用农杆菌转化法将抗除草剂基因导入甘蓝，过程如图1所示，为操作步骤，限制酶BamHI、Bgl、EcoRI酶切位点唯一，BamHI和EcoRI之间的距离为20kb，BamHI和Bgl之间距离为25kb,识别序列和切割位点如表4所示请回答：限制酶识别序列和切割位点Bam HI G GATCCBgl A GATCTEcoRI G AATTC1.使用电泳进行检测考法3 正反接的检测（难点，需要绘图）2）目的基因用BamHI和Bgl剪切，质粒用BamHI剪切，剪切后的目的基因和质粒能连接在一起，原因是_酶切后的目的基因存在正向与反向两种连接方式，可用 _酶对两种重组质粒进行剪切，通过凝胶电泳分析产物大小进行区分，如图2所示，图中(填“样品1”或“样品2”)为所需基因表达载体切割DNA后产生相同的黏性末端BamH I和EcoR I 样品2限制酶识别序列和切割位点Bam HI G GATCCBgl A GATCTEcoRI GAATTC 难点分析：笔记：同尾酶的酶切切位可以连接，但是连接后，不能再被这两种酶识别4）易错题：步骤将农杆菌与甘蓝愈伤组织共培养后，在步骤的培养基中添加_以便筛选岀含目的基因的甘蓝植株。
答案是潮霉素，因为只有TDNA中的基因会到整合到植物当中！限制酶识别序列和切割位点Bam HI G GATCCBgl A GATCTEcoRI GAATTC2019江苏 图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)请回答下列问题：1)EcoR 酶切位点为 ，EcoR 酶切出来的线性载体P1为_末端平2)用Taq酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为_的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在_酶作用下，形成重组质粒P3胸腺嘧啶(T)DNA连接2.利用PCR进行检测考法3 正反接的检测（难点，需要绘图）3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如表(“”代表生长，“”代表不生长)根据表中结果判断，应选择的菌落是_(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是_、_菌落类型平板类型ABC无抗生素氨苄青霉素四环素氨苄青霉素四环素BA类菌落含有P0C类菌落未转入质粒4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。
图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是_某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是_乙、丙目的基因反向连接1.反义基因：是指一段与mRNA或DNA特异性结合并阻断其基因表达的人工合成的DNA分子2.双链RNA：类似前者，在同个基因内部插入反序列导致mRNA形成发卡3.CRISRP/Cas9：课本出现两处考法4 基因组编辑（基因敲除或抑制）1.反义基因：注意构建的目的基因与需要抑制的基因序列相反2023陕西一模，结合了上一讲为目的基因添加酶切位点和本节反义基因 维生素A在体内转化为11-顺式视黄醛后，与视网膜特定细胞中的视蛋白结合成视紫红质视紫红质接受光信号后，11-顺式视黄醛转变为全反式视黄醛，视紫红质构象发生变化，激活细胞内的信号通路，最。