微生物的培养技术及应用课件

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1、1.2 1.2 微生物的培养技术与应用微生物的培养技术与应用（一）培养基（一）培养基1.概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。基础知识基础知识2.类型：按物理性质划分：按化学成分划分：按用途划分：按按物理性质划物理性质划分分：固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基有有 无无 凝固凝固剂剂( (琼脂琼脂) )微生物的分离、鉴定、微生物的分离、鉴定、活菌计数、菌种保藏活菌计数、菌种保藏工业生产工业生产按按化学成分化学成分划划分：分：天然培养基天然培养基合成培养基合成培养基（天然物质，成分不明确）如：牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基如：高氏1号培养基、查氏培养基（

2、培养基成分明确）按用途按用途划划分：分：基础培养基基础培养基鉴别培养基鉴别培养基含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质将某种类微生物从混杂的微生物群体中分离出来在培养基中加入某种指示剂或化学药品，用于鉴别不同类型微生物的培养基选择培养基选择培养基培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需的微生物的生长伊红美蓝培养基可以鉴别培养基可以鉴别大肠杆菌（菌落呈深紫色，并带有金属光泽）（菌落呈深紫色，并带有金属光泽）培养基培养基分离得到分离得到加入青霉素酵母菌和霉菌加入高浓度的食盐金黄色葡萄球菌以尿素作为唯一氮源分解尿素的细菌不添加氮源固氮微生物3.3.培养基的成分培养基的成分碳源

3、氮源水无机盐无机碳源：有机碳源：CO2、CO32-、HCO3-等牛肉膏、蛋白胨等无机氮源：有机氮源：NH4、NO3-等牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等培养基还需要满足不同微生物生长对pH、氧气及特殊营养物质的要求。培养的微生物需要满足的其他要求乳酸杆菌培养基中添加维生素霉菌将pH调至酸性细菌将pH调至中性或微碱性厌氧微生物需要提供无氧条件（二）无菌技术（二）无菌技术基础知识基础知识为了获得纯净培养物，防止外来杂菌的入侵。1.消毒与灭菌u消毒：是指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）。u灭菌：是指使用强烈的物理因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。

4、2.常用的消毒方法u煮沸消毒u巴氏消毒u化学试剂消毒u紫外线消毒日常生活常用，在100，煮沸56min。牛奶，在62-65，消毒30min或在80-90处理30s-1min。用75%的酒精进行皮肤消毒；氯气消毒水源实验室、教室等空间 紫外线照射30min。3.常用的灭菌方法u灼烧灭菌u干热灭菌u高压蒸汽灭菌接种环、接种针、试管口、瓶口玻璃器皿、金属用具 160-170，2-3h。培养基、实验器材 100kPa，121，15-30min。学习小结学习小结 酵母菌的纯培养酵母菌的纯培养（一）制备培养基（一）制备培养基1.1.计算计算实验操作实验操作（制备培养基、纯化酵母菌）（制备培养基、纯化酵母菌

5、）2.2.称量称量根据配方比例，计算配制1000mL培养基各成分的用量。（一）制备培养基（一）制备培养基3.3.马铃薯200g，切小块加水1000ml，加热煮沸至马铃薯腐烂纱布过滤 滤液中加入20g葡萄糖，15-20g琼脂 补加蒸馏水至1000mL（定容）调节pH？（一）制备培养基（一）制备培养基4.4.灭菌灭菌（1）培养基 转到锥形瓶，加棉塞，用牛皮纸或旧报纸包裹,皮筋勒紧，放入高压蒸汽灭菌锅灭菌，100kpa，121，灭菌15-30min（2）5-8套培养皿包一包，用牛皮纸包紧， 干热灭菌,160-170灭菌2h（一）制备培养基（一）制备培养基5.5.倒平板倒平板待培养基冷却至50左右；在

6、酒精灯火焰附近倒平板； 等平板冷却凝固后，倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。防止皿盖上的冷凝水掉入培养基，造成污染（二）接种和分离酵母菌（二）接种和分离酵母菌1.1.平板划线法平板划线法原理：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体（单菌落）。（三）培养酵母菌（三）培养酵母菌完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28左右的恒温培养箱中培养24-48h（二）纯化大肠杆菌（二）纯化大肠杆菌1.1.平板划线法平板划线法分区划线法分区划线法连续划线法

7、连续划线法问题探讨问题探讨为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物； 每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。 划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。问题探讨问题探讨在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端

8、开始划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 微生物的选择培养与计数微生物的选择培养与计数1、 科学实例科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。筛选原因：因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，使耐热的Taq细菌保留下来。PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。1966年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的Taq细菌，并分离到耐

9、高温的DNA聚合酶（Taq酶）。（一）筛选菌株耐高温的酶耐高温生物体高温环境（热泉、火山口）寻找寻找结果：培养一定时间后，目的菌数量上升，再通过稀释涂布平板等方法对它进行纯化培养。2、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。（一）筛选菌株允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，叫做选择培养选择培养基基。不加有机碳源 不加氮源3.选择培养基自养微生物酵母菌和霉菌固氮微生物加入青霉素加高浓度食盐金黄色葡萄球菌石油是唯一碳源（一）筛选菌株能消除石油污染的微生物稀释涂布平板法稀释涂布平板法原理：将菌

10、液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。（二）微生物的选择培养.系列稀释操作a.编号为101106试管中分别盛有 水。b.用移液管吸取 培养的菌液，注入101倍稀释的试管中，得到稀释菌液。c.从101倍稀释的试管中吸取1 mL稀释液，注入102倍稀释的试管中。依次类推，完成菌液的稀释。注意注意移液管要经过灭菌，并且操作应在酒精灯火焰附近完成。9 mL1 mL.涂布平板操作涂布器消毒：将涂布器浸在盛有 的烧杯中取菌液：取少量菌液（不超过0.1mL)滴加到 表面涂布器灭菌：将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃

11、，待酒 精燃尽后， 810 s涂布平板：用涂布器将 均匀涂布在培养基表面，涂布 时可转动培养皿，使菌液分布均匀酒精培养基冷却菌液2.2.培养培养1个不接种平板（空白对照组）三组，每组3个涂布平板（重复实验）1、显微镜直接计数： 利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里 样品中微生物的数量。不能区分死菌与活菌（数值偏大）；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点：（三）微生物的数量测定2.间接计数法（活菌计数法） （1）常用方法：稀释涂布平板法。 （2）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的 一个菌落是由一个活菌繁殖而成的。

12、（三）微生物的数量测定例题例题某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的细菌数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml） ( ) A. 2.34108 B. 2.34109 C. 234 D. 23.4 B每克样品中的菌株数 =（CV）MC：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积（：代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL）。）。M：代表稀释倍数。：代表稀释倍数。注意事项选择菌落数在30-300的平板上进行计数。用三个或三个以上的平板，计算出菌落平均数（重复实验，减少误差

13、）。统计的细菌数往往比实际数目低。因此，统计结果一般用菌落数 而不是活菌数表示。因为当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落（三）微生物的数量测定说说明明重重复复实实验验的的重重要性要性。第一位同学：没有第一位同学：没有重复实验重复实验（至少涂布（至少涂布3 3个平板个平板）。）。第二位同学第二位同学：2121这个数据小于这个数据小于3030，说明误差较大，不，说明误差较大，不应应用用 于于计算平均计算平均值。值。实验案例：实验案例：实验案例实验案例2 2：在在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A A同学从对应的同学从对应的1

14、0106 6倍稀释的培养基中筛选出大约倍稀释的培养基中筛选出大约150150个个菌落菌落，但但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约5050个个菌落菌落。可可能的原因有哪些？能的原因有哪些？A的土样不同A的培养基污染或操作失误通通过这过这个实验案例可个实验案例可以看出，实验结果要有说服力，以看出，实验结果要有说服力，对照的设置对照的设置是必不可少的。是必不可少的。验证假设一：验证假设一：其其他同学用与他同学用与A A同学相同土同学相同土样进样进行实验行实验 验证假设二：验证假设二：将将A A同学配制的培养同学配制的培养基，在基，在不加土样不加土样的情况的情

15、况下进行培养，作为下进行培养，作为空白对照空白对照，以证明培养基是否受到污染。，以证明培养基是否受到污染。如如果结果与果结果与A A同学一致，则证明同学一致，则证明A A无误无误；如如果结果不同，则证明果结果不同，则证明A A同学存在操作失误或培养同学存在操作失误或培养基污染。基污染。判断培养基中是否有杂菌污染：将未接种的培养基同时进行培养。判断选择培养基是否具有筛选作用：完全培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）接种后培养观察菌落数目。 主要目的是排除实验组中非测试因素（无关变量）对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。（四）设置对照2021土 壤 中 分 解 尿 素 的 细 菌 的 分 离土 壤 中

16、 分 解 尿 素 的 细 菌 的 分 离与 计 数与 计 数1、尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、细菌能利用尿素的原因土壤中的某些细菌能分解尿素是因为它们能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2) )2 2脲酶脲酶 + H + H2 2OO+ CO+ CO2 22 2NHNH3 3一、课题背景一、课题背景3、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。4、课题目的从土壤中分离出能够分解尿素的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌一、课题背景一、课题背景实验流程：实验流程：样品稀释涂布平板样品稀释涂布平板微生物的培养与观察微生物的培养与观察 菌落计数菌落计数土壤取样土壤取样制备培养基制备培养基二、实验设计二、实验设计从从肥肥沃沃、酸酸碱碱度度接接近近中中性性的的湿湿润润土土壤壤中中取取样样绝绝大大多多数数分分布布在在距距地地表表3-8cm3-8cm的的土土壤壤层层。先先铲铲去去表表层层土土3 3 cmcm左左右右，再再取取样样，将将样样品