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1、分子诊断技术平台的进展及展望分子诊断技术平台的进展及展望内内 容容病原体检测技术概述病原体检测技术概述病原体核酸检测技术概述病原体核酸检测技术概述病原体核酸检测新技术应用病原体核酸检测新技术应用核酸检测新技术存在问题及发展核酸检测新技术存在问题及发展背背景景治治 疗疗 近近1010年新发传染病绝大多数是病毒引起年新发传染病绝大多数是病毒引起病毒与亚病毒6819种408属动物病毒1917种204属感染人296种37属背景背景病毒分离培养血清学鉴定PCR 和DNA测序NGS测序背景检测技术概述形态学（电镜）形态学（电镜）组织学（细胞培养）组织学（细胞培养）免疫学（免疫学（ELISA,Western
2、ELISA,Western Blot, Blot, IF,NT,HI IF,NT,HI）分子生物学（分子生物学（PCR,RT-PCR,RT-PCR,qPCR,mPCRPCR,qPCR,mPCR, , Microarray,SequencingMicroarray,Sequencing） 传统检测方法的局限性传统检测方法的局限性 胶体金胶体金 （灵敏度（灵敏度 窗口期）窗口期） ELISA ELISA （灵敏度（灵敏度 窗口期）窗口期） PCR/RT-PCR PCR/RT-PCR （通量（通量 未知病原）未知病原） Real-time PCR Real-time PCR （通量（通量 未知病原未
3、知病原) ) 巣式巣式PCR/RT-PCR (PCR/RT-PCR (污染，电泳）污染，电泳） 核酸扩增检测技术概述核酸扩增检测技术概述 核酸扩增技术是一种常规生物技术，是分子生物学的基础研究方法。核酸扩增技术是一种常规生物技术，是分子生物学的基础研究方法。作为主流检测技术被广泛应用于实验室、医院。作为主流检测技术被广泛应用于实验室、医院。 核酸扩增技术可分为核酸扩增技术可分为变温扩增技术变温扩增技术和和等温扩增技术等温扩增技术。变变 温温 扩扩 增增PCRPCRRealtimeRealtime PCR PCRRT PCRRT PCRNested PCRNested PCRMultiplex
4、PCRMultiplex PCRDigital PCRDigital PCR等等 温温 扩扩 增增TMA/NASBATMA/NASBASMARTSMARTHDAHDASDA/NDASDA/NDARCA/MDARCA/MDALAMPLAMP/ /IMSAIMSAIMSAIMSARPARPARPARPA基于基于T7 PromoterT7 Promoter基于解旋酶基于解旋酶基于链置换活性的基于链置换活性的DNA DNA 聚合酶聚合酶链置换和重组酶链置换和重组酶核酸检测新技术核酸检测新技术 LAMP/IMSA/RPA LAMP/IMSA/RPA Multiplex PCR Multiplex PCR
5、 Nested PCR ( Nested PCR (一步法）一步法） Digital PCR Digital PCR 自动化检测自动化检测 再测序芯片再测序芯片 PCR PCR 阵列阵列 二代测序（二代测序（NGSNGS） POCT POCT（现场检测）（现场检测） 核酸检测技术发展趋势 未知病原 多病原 高通量 自动化 现场技术 (POCT)中中 心心 实实 验验 室室 科科 研研 方方 向向 简简 介介 未知病原检测技术平台 高通量自动化工作站技术平台 多病原、症候群检测技术平台 现场检测技术平台4123u现场检测技术-LAMP,IMSAu多病原检/监测技术 -GeXP, Qiaxcel,
6、 RPMu未知病原鉴定未知病原鉴定 - NGS，VIDISCA,RPMu自动化检测- Liquid handling systemu 生物信息学支持- VIP软件 检测检测/ /监测监测/ /鉴定鉴定技术平台技术平台技术平台定位功能实际应用相关英文文章（中文文章略）未知病原鉴定国家级技术服务和支撑Tembusu Virus in ducks, China, Echo 33Echo33J. Virol. 2012, 86(6):3406Emerging Infect Dis, 2011. 17 (10):1873Archive virology, 2014， DOI 10.1007自动化检测 国
7、家级技术服务和支撑全国分子和血清学流行病学调查，大规模SNP分析J. Infection 2011，62(1):107BMC Infect Dis, 2010， 10:178Inflam. Bowel Dis 2011,1 7(12):2472PLOS One , 2013, 8(1): e55197多病原检测/监测省级高通量检测和症候群监测呼吸道(9+7)，手足口，流感，腹泻，HPV分型，SNP，耐药,转基因，脑炎J Virol Met. 168 (2010) 255258Adv. in Virology 2011: 129134J. Clin. Microbiol 2012, 50(2):
8、288J.Med Virol. 2012, 84:957J. Clin. Microbiol. 2012, 50(7)：2384BMC Infect Dis, 2012,12:189BMC Microbiology 2013, 13:58PLOS One, 2013 (accepted)现场检测地市级现场初步筛查手足口，H1N1H1N1，H7N9H7N9流流感感，诺如病毒, HPV，HIV，HCV,MERS, EbolaJ Virol Met 2010,167(2), 214J Virol Met 2011,175:283J. Clin. Microbiol 2011, 49(10）3545P
9、LOS One ,2012,7(12): e52486Adv. in Infect Dis, 2012, 2, 110-118 生物信息学软件DS2，VIP 国家级技术服务和支撑表位分析，抗原抗体相互作用J Virol Met 181 (2012) 182 187 Biomed Environ Sci, 2012; 25(1): 98-103 病毒检测病毒检测/监测监测/签定技术平台及生物信息学签定技术平台及生物信息学 核酸检测新技术核酸检测新技术 LAMP/IMSAIMSA/RPA/RPA Multiplex PCR Nested PCR (一步法） Digital PCR 自动化检测 再测
10、序芯片 PCR 阵列 二代测序（NGS） POCT（现场检测） LAMPLAMP技术特点技术特点u 特异性强特异性强: 2: 2对引物配对对引物配对6 6个区域或个区域或3 3对引物配对对引物配对8 8个区域个区域u 灵敏度高：灵敏度高： 10-100 copies10-100 copiesu 设备要求低设备要求低: : 不需要不需要PCRPCR仪器，仪器，65 65 水浴（等温）水浴（等温）u 检测快速：检测快速： 1 1小时小时u 操作简单：操作简单： 一步法（单管）一步法（单管）u 结果判定方便：颜色（肉眼观察颜色变化和沉淀）结果判定方便：颜色（肉眼观察颜色变化和沉淀） 吸光值（半定量，
11、吸光值（半定量，650nm650nm比色）比色） 普通琼脂糖电泳普通琼脂糖电泳 浊度（浊度仪，实时监测，半定量）浊度（浊度仪，实时监测，半定量） 实时荧光定量PCR仪2小时水浴、热块、PCR仪、浊度仪电泳、浊度、颜色指示剂、肉眼观察1小时25￥/Reaction仪器要求实验结果反应时间实验成本Realtime PCR 与 LAMPLAMP 特点比较Realtime PCRLAMPVS实时荧光定量PCR仪50￥/ReactionLAMP 结 果 分 析肉 眼 观 测焦磷酸镁沉淀DNA显色剂Mg2+显色剂仪 器 检 测凝胶电泳实时浊度仪病原体检测LAMP扩 展JVirolMet2010,167(2
12、),214H1N1JVirolMet2011,175:283AdvancesinInfect.Dis.2012EV71CA16JClin.Microbiol2011,49(10):3545HPVNorVPLOSOne2012,7(12)directLAMP定量HIVIMSA/EV71/CA16JCM,2014,52（6):1862MERS(submitted)Gene,2014,541,123-128Foodandenviromentalvirology,2014GEAR/HRVClinMicrobiolInfect.2013H7N9submitted 内容：LAMP检测技术应用于手足口病例的
13、现场评价 合作单位：湖南、山东、河北省CDC 标本数量：手足口500份（每省）LAMP 技术的现场评价LAMP 技术现场评价LAMP 检测技术应用于手足口病例的评价 (湖南)-Advances in Infect. Dis. -Advances in Infect. Dis. 2012, 4(2) 110-118试验真阳性(TP)真阴性(TN)合计LAMP阳性233(DP)0(FP)233LAMP阴性0(FN)282(DN)282总数233282515肠道病毒EV71型核酸检测结果比较肠道病毒CoxA16型核酸检测结果比较试验真阳性(TP)真阴性(TN)合计LAMP阳性103(DP)0 (FP
14、)103LAMP阴性2(FN)410(DN)412总数105410515p小结临床标本515份EV71符合率100%CA16符合率99.6%参照：国产RealTime PCR 检测试剂盒IMSA (Isothermal Multiple Self-matching-initiated Amplification) 目的：建立具有自主知识产权的等温多自配体 引发扩增反应 专利进入实质审查 引物设计软件：www.imsa-IMSA 与 LAMP 的特点比较IMSALAMP引物6条4-6条靶基因上的7个位点靶基因上的6-8个位点外引物为混合型：对应2个位点外引物只对应1个位点内引物5端互补-外/内/
15、茎=1/4/8外/内/环=1/8/4扩增反应产生4种可自我循环复制的基本结构产生1种可自我循环复制的基本结构所有引物在反应中持续起作用外引物只在反应初始起作用IMSA 与 LAMP 方法检测手足口病结果IMSA方法在常见传染病检测中的应用方法在常见传染病检测中的应用IMSA法针对EV71和CVA16 检测的最低检测线：利用概率元分析法（probit analysis）拷贝数（copies/反应）阳性数/总测试数，括号外为EV71的测试，括号内为CVA16的测试IMSA实时浊度法mHNB颜色判定法（IMSA）HNB颜色判定法（IMSA）LAMP实时浊度法1000015/15(15/15)15/1
16、5(15/15)15/15(15/15)15/15(15/15)500015/15(15/15)15/15(15/15)15/15(15/15)15/15(15/15)100015/15(15/15)15/15(15/15)15/15(15/15)9/15(15/15)50012/15(15/15)10/15(15/15)9/15(15/15)6/15(15/15)2509/15(15/15)9/15(15/15)6/15(15/15)3/15(12/15)1006/15(15/15)6/15(15/15)3/15(15/15)3/15(6/15)503/15(12/15)3/15(9/15)0/15(9/15)0/15(3/15)250/15(9/15)0/15(6/15)0/15(3/15)0/15(0/15)100/15(3/15)0/15(3/15)0/15(0/15)0/15(0/15)50/15(3/15)0/15(0/15)0/15(0/15)0/15(0/15)10/15(0/15)0/15(0/15)0/15(0/15)0/15(0/15)93710391749326
