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1、本文格式为Word版，下载可任意编辑蛋白酶活性测定方法 水产动物酶活性测定方法 一、分析样品的采取与处理 每箱随机各取3尾异育银鲫，称重,于冰盘上解剖，取出肠道和肝胰脏,测定肠道长度，剔除脂肪组织，用4冷却的去离子水冲洗；然后用滤纸轻轻吸去水分，放入26冰箱中急速冷却保存，供测酶活性用。 二、酶液的制备 将肝胰脏及肠组织缓慢解冻后，肠道匀分三等份，从前、中、后肠分别取有代表性食靡0.5g，放入离心塑料管中，加4ml，4冷却去离子水稀释，4下离心20min（13，000g），上清液标号分装，并与4冰箱中冷却保存，24Hr待测。 将肝胰脏及肠道组织用4去离子水除掉肠道内容物后，用滤纸吸去外观水，取
2、样各1.0g。按样品重量加10倍的4冷却去离子水在冰浴下匀浆（稀释匀浆液匀浆4min,800rpm匀浆玻璃管外设冰浴）。匀浆液在4下离心20分钟（13，000g），上清液标号分装，并于4冰箱冷却保存，24Hr内测定完毕。 酶粉及饲料： 取20克酶粉，先用10倍PH7.0缓冲液溶解，并放在40水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。测定前再稀释10倍，20倍，100倍即可。 取2.0克饲料，加PH7.0缓冲液20ml溶解, 并放在40水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。 三、酶活性测定 1. 蛋白酶测定：前、中、后肠，肝胰脏。 方法：福林酚试剂法 1.1原理：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三
3、氯乙酸（TCA）的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等），这些氨基酸可用福林试剂使之发色（蓝色回响），用分光光度计测定。 1.2蛋白酶活性单位： 1克食靡或组织在30，PH在7.0的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸的酶量为1个酶活力单位。 1.3试剂 1. 福林试剂（已配） 2. 0.4M 碳酸钠溶液：取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g用水溶解和定容至1， 000ml，存放与具胶塞的试剂瓶中。 3. 0.1M三氯醋酸（TCA）：用小烧杯称取65.4g三氯醋酸，加水溶解后定容为 1，000ml。 4. L酪氨酸。 5. 缓冲液：磷酸二氢钙氢氧化钠缓冲液。 A：0.2mol/L KH2
4、PO4 (ml): 50; B：0.2mol/L NaOH(ml) 29.63 C：水（ml） 120.37 PH（20）： 7.0 6酪蛋白溶液：精确称取酪素2.000g，先用少量0.5N 氢氧化钠浸润后，参与 少量缓冲液，在沸水浴中加热，经常但不要强烈的搅拌使之完全溶解，冷却后移入100ml容量瓶中，并用相应的缓冲液定容到刻度。若定容时泡沫过多，可参与12滴乙醇消泡。酪蛋白溶液可在4保存一周，变质后不能使用。 1.4标准酪氨酸曲线的绘制 1. 将精确称取L酪氨酸（先在105枯燥23Hr）100mg提防地溶于60ml 0.1mol/L HCL 中制得酪氨酸溶液。酪氨酸务必完全枯燥并且是色谱级
5、别，确定要酪氨酸完全溶解，并且用去离子水稀释至1L ，该溶液含酪氨酸100微克/毫升。 2. 根据下面的规定，从上述储蓄溶液制备含酪氨酸10、20、30、40、50、 70、80微克/毫升。 3. 移取上述溶液2ml，参与一系列试管中，加5ml 0.4M Na2CO3然后加稀释 的福林试剂1ml至各试管，立刻混合平匀，并在30恒温水浴中显色20min，以721型（或72型）分光光度计在波长680nm处测定光密度（O。D值）。 4. 计算K值；以OD值为纵坐标，酪氨酸溶度为横坐标，绘制标准曲线， 微克数，确定K值。 1.5 操作步骤 将酪蛋白溶液放入30恒温水浴中预热5min，取1ml酶液注入试
6、管中， 按以下程序操作。 酶液1ml在30恒温水浴中预热12min + 2%酪蛋白1ml参与时立刻记时，精确回响10min + 0.4MTCA 2ml立刻摇匀，终止回响。 将各管强烈混合并在30保持30min，以完全沉淀回响后过量的酪蛋白。 从水浴中取出静止10min过滤（11cm的whatman43#滤纸） + 滤液1ml + 0.4M Na2CO3 5ml + 稀释福林试剂1ml 摇匀，30恒温水浴显色20分钟 测定OD 值用720型分光光 度计测定（波长680nm） 空白试验：酶液1ml，先向其中参与三氯醋酸，然后加酪蛋白溶液。其余步骤同试验。 1.6 计算公式 （公式1） 活力单位=4
7、/10KODn/m 其中：4回响总体积为4ml 10回响的时间为10min K比色计常数 n酶液稀释倍数 m-样品的质量（g） （公式2） 活力单位=4n/10/m 其中：酶活力测定的光密度值，在标准曲线上查得 响应的酪蛋白的微克数。 4回响的总体积 10回响10分钟 n 酶稀释倍数 m-样品的质量（g） 2碘淀粉比色法测定淀粉酶 21原理 淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖及糊精，在底物浓度已知并且过量的处境下，参与碘液与未水解的淀粉生成蓝色复合物，根据蓝色的深浅可推算出水解的淀粉量，从而计算AMS 的活力。 22试剂 1 0.4mg/ml 底物缓冲液： 60ml2瓶，4冰箱保存。 20.1
8、mol/L 碘储蓄液：7ml2瓶，4避光保存。 0.01mol/L 碘应用液的配制：将储蓄液：蒸馏水=1：9稀释，4避光保存。 23操作 酶液（ml） 碘应用液(ml) 蒸馏水 测定管（u管） 0.02 1.0 6.0 空白管（o）管 1.0 1.0 6.02 底物缓冲液(ml)30预温5分钟 1.0 混匀，30水浴， 切实回响7.5分钟 混匀在660nm波长，1cm光径，蒸馏水调零测光密度。 24活性单位： 1克食靡或组织中AMS，在30与底物作用1min，水解1mg淀粉为1个单位。 25计算公式 （空白管吸光度测定管吸光度）0.41min 4 F AMS u/dl= 空白管吸光度 1.07
9、.5min0.02M 注： 0.4- 底物缓冲液浓度 1.0- 活性单位定义水解1mg淀粉量 4- 酶液稀释了4倍 0.02 - 酶液 F- 测定时稀释的倍数 W- 样品重量（g） 3脂肪酶活性测定 加5mL 0.025 mol/L pH 7.5磷酸缓冲液和4mL聚乙烯醇橄榄油乳化液于100 mL锥形瓶中，置回响温度（37）水浴中预热510min，然后参与匀浆粗酶液1mL，切实回响30min后，立刻参与95%乙醇15mL，终止酶回响。加1%酚酞指示剂3滴，用0.05mol/L标准氢氧化钠滴定至微红色，同时以1mL已变性失活的酶液做空白对照。 脂肪酶活性定义为：在上述回响条件下，1g组织中的脂肪酶1min催化脂肪水解产生1mol脂肪酸的酶量定为一个活力单位(U)。 7
