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1、本文格式为Word版,下载可任意编辑蛋白酶活性测定方法 水产动物酶活性测定方法 一、分析样品的采取与处理 每箱随机各取3尾异育银鲫,称重,于冰盘上解剖,取出肠道和肝胰脏,测定肠道长度,剔除脂肪组织,用4冷却的去离子水冲洗;然后用滤纸轻轻吸去水分,放入26冰箱中急速冷却保存,供测酶活性用。 二、酶液的制备 将肝胰脏及肠组织缓慢解冻后,肠道匀分三等份,从前、中、后肠分别取有代表性食靡0.5g,放入离心塑料管中,加4ml,4冷却去离子水稀释,4下离心20min(13,000g),上清液标号分装,并与4冰箱中冷却保存,24Hr待测。 将肝胰脏及肠道组织用4去离子水除掉肠道内容物后,用滤纸吸去外观水,取
2、样各1.0g。按样品重量加10倍的4冷却去离子水在冰浴下匀浆(稀释匀浆液匀浆4min,800rpm匀浆玻璃管外设冰浴)。匀浆液在4下离心20分钟(13,000g),上清液标号分装,并于4冰箱冷却保存,24Hr内测定完毕。 酶粉及饲料: 取20克酶粉,先用10倍PH7.0缓冲液溶解,并放在40水浴中恒温30分钟,过滤留置滤液待测。测定前再稀释10倍,20倍,100倍即可。 取2.0克饲料,加PH7.0缓冲液20ml溶解, 并放在40水浴中恒温30分钟,过滤留置滤液待测。 三、酶活性测定 1. 蛋白酶测定:前、中、后肠,肝胰脏。 方法:福林酚试剂法 1.1原理:蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三
3、氯乙酸(TCA)的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等),这些氨基酸可用福林试剂使之发色(蓝色回响),用分光光度计测定。 1.2蛋白酶活性单位: 1克食靡或组织在30,PH在7.0的条件下,每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸的酶量为1个酶活力单位。 1.3试剂 1. 福林试剂(已配) 2. 0.4M 碳酸钠溶液:取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g用水溶解和定容至1, 000ml,存放与具胶塞的试剂瓶中。 3. 0.1M三氯醋酸(TCA):用小烧杯称取65.4g三氯醋酸,加水溶解后定容为 1,000ml。 4. L酪氨酸。 5. 缓冲液:磷酸二氢钙氢氧化钠缓冲液。 A:0.2mol/L KH2
4、PO4 (ml): 50; B:0.2mol/L NaOH(ml) 29.63 C:水(ml) 120.37 PH(20): 7.0 6酪蛋白溶液:精确称取酪素2.000g,先用少量0.5N 氢氧化钠浸润后,参与 少量缓冲液,在沸水浴中加热,经常但不要强烈的搅拌使之完全溶解,冷却后移入100ml容量瓶中,并用相应的缓冲液定容到刻度。若定容时泡沫过多,可参与12滴乙醇消泡。酪蛋白溶液可在4保存一周,变质后不能使用。 1.4标准酪氨酸曲线的绘制 1. 将精确称取L酪氨酸(先在105枯燥23Hr)100mg提防地溶于60ml 0.1mol/L HCL 中制得酪氨酸溶液。酪氨酸务必完全枯燥并且是色谱级
5、别,确定要酪氨酸完全溶解,并且用去离子水稀释至1L ,该溶液含酪氨酸100微克/毫升。 2. 根据下面的规定,从上述储蓄溶液制备含酪氨酸10、20、30、40、50、 70、80微克/毫升。 3. 移取上述溶液2ml,参与一系列试管中,加5ml 0.4M Na2CO3然后加稀释 的福林试剂1ml至各试管,立刻混合平匀,并在30恒温水浴中显色20min,以721型(或72型)分光光度计在波长680nm处测定光密度(O。D值)。 4. 计算K值;以OD值为纵坐标,酪氨酸溶度为横坐标,绘制标准曲线, 微克数,确定K值。 1.5 操作步骤 将酪蛋白溶液放入30恒温水浴中预热5min,取1ml酶液注入试
6、管中, 按以下程序操作。 酶液1ml在30恒温水浴中预热12min + 2%酪蛋白1ml参与时立刻记时,精确回响10min + 0.4MTCA 2ml立刻摇匀,终止回响。 将各管强烈混合并在30保持30min,以完全沉淀回响后过量的酪蛋白。 从水浴中取出静止10min过滤(11cm的whatman43#滤纸) + 滤液1ml + 0.4M Na2CO3 5ml + 稀释福林试剂1ml 摇匀,30恒温水浴显色20分钟 测定OD 值用720型分光光 度计测定(波长680nm) 空白试验:酶液1ml,先向其中参与三氯醋酸,然后加酪蛋白溶液。其余步骤同试验。 1.6 计算公式 (公式1) 活力单位=4
7、/10KODn/m 其中:4回响总体积为4ml 10回响的时间为10min K比色计常数 n酶液稀释倍数 m-样品的质量(g) (公式2) 活力单位=4n/10/m 其中:酶活力测定的光密度值,在标准曲线上查得 响应的酪蛋白的微克数。 4回响的总体积 10回响10分钟 n 酶稀释倍数 m-样品的质量(g) 2碘淀粉比色法测定淀粉酶 21原理 淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖及糊精,在底物浓度已知并且过量的处境下,参与碘液与未水解的淀粉生成蓝色复合物,根据蓝色的深浅可推算出水解的淀粉量,从而计算AMS 的活力。 22试剂 1 0.4mg/ml 底物缓冲液: 60ml2瓶,4冰箱保存。 20.1
8、mol/L 碘储蓄液:7ml2瓶,4避光保存。 0.01mol/L 碘应用液的配制:将储蓄液:蒸馏水=1:9稀释,4避光保存。 23操作 酶液(ml) 碘应用液(ml) 蒸馏水 测定管(u管) 0.02 1.0 6.0 空白管(o)管 1.0 1.0 6.02 底物缓冲液(ml)30预温5分钟 1.0 混匀,30水浴, 切实回响7.5分钟 混匀在660nm波长,1cm光径,蒸馏水调零测光密度。 24活性单位: 1克食靡或组织中AMS,在30与底物作用1min,水解1mg淀粉为1个单位。 25计算公式 (空白管吸光度测定管吸光度)0.41min 4 F AMS u/dl= 空白管吸光度 1.07
9、.5min0.02M 注: 0.4- 底物缓冲液浓度 1.0- 活性单位定义水解1mg淀粉量 4- 酶液稀释了4倍 0.02 - 酶液 F- 测定时稀释的倍数 W- 样品重量(g) 3脂肪酶活性测定 加5mL 0.025 mol/L pH 7.5磷酸缓冲液和4mL聚乙烯醇橄榄油乳化液于100 mL锥形瓶中,置回响温度(37)水浴中预热510min,然后参与匀浆粗酶液1mL,切实回响30min后,立刻参与95%乙醇15mL,终止酶回响。加1%酚酞指示剂3滴,用0.05mol/L标准氢氧化钠滴定至微红色,同时以1mL已变性失活的酶液做空白对照。 脂肪酶活性定义为:在上述回响条件下,1g组织中的脂肪酶1min催化脂肪水解产生1mol脂肪酸的酶量定为一个活力单位(U)。 7