本文格式为Word版，下载可任意编辑反转录TAKARA D6210A TaKaRa Code：D6210A PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit （50次量） 宝生物工程(大连)有限公司 目 录 内 容 ●制品说明 ●制品内容 ●保 存 ●1st-strand cDNA合成回响 ●RT-PCR回响 ●RNA样品的制备 ●相关制品 页 码 1 1 1 2 2 3 3 ●制品说明 本制品是使用PrimeScript II RTase从Total RNA或Poly（A）＋ RNA合成1st Strand cDNA的试剂盒含有1st Strand cDNA合成所需的全部试剂 以布局繁杂的RNA或长链RNA为模板举行cDNA合成时，cDNA合成受到抑制的主要理由是RNA高级布局与反转录酶的非特异性结合并且，由于反转录酶的错配引起的非特异性延迟，对RT-PCR或全长cDNA的合成极为不利PrimeScript II RTase是对PrimeScript RTase举行进一步革新的反转录酶，本反转录酶可以极大限度地抑制RNA高级布局与反转录酶的非特异性结合。
本制品使用了PrimeScript II RTase，利用Oligo dT从PolyA开头举行延迟回响，使用标准反转录温度42℃，不仅能维持PrimeScript RTase原有的卓越的cDNA合成效率和cDNA合成速度，同时可以合本金底低、纯度高、完整性好的cDNA另外，反转录回响液配制时所产生的非特异性延迟是抑制cDNA合成的主要理由，本制品能有效操纵这一现象回响液配制后，冰上放置直至反转录回响开头，不会发生抑制cDNA合成的现象 合成的1st Strand cDNA可广泛应用于2nd Strand cDNA合成、杂交、PCR法扩增等更加适用于全长cDNA文库制作、高纯度全长cDNA合成等 ●制品内容（50次量） PrimeScript II RTase（200 U/μl） 5PrimeScript II Buffer RNase Inhibitor（40 U/μl） dNTP Mixture（10 mM each） Oligo dT Primer（50 μM） Random 6 mers（50 μM） RNase free dH2O 50 μl 200 μl 25 μl 50 μl 50 μl 100 μl 1 ml 【引物序列】 引物名称 Random6 mers Oligo dT PrimerPd（N）6序列 TaKaRa自身开发设计的dT区域的序列﹡1*1：该序列与TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0（TaKaRa Code: DRR019A） 中的Oligo dT Adaptor Primer不同，不含有M13 Primer M4序列。
●保 存： -20℃ ●1st-Strand cDNA合成回响 1. 在Microtube中配制以下混合液 试剂 Oligo dT Primer（50 μM） or Random 6 mers（50 μM） dNTP Mixture（10 mM each） 模板RNA RNase Free dH2O 使用量 1 μl 1 μl（0.4～2 μl）*2 1 μl Total RNA：5 μg 以下 Poly(A)＋ RNA：1 μg 以下 Up to 10 μl 2．65℃保温5 min后，冰上急速冷却 *2：2 kb以下的cDNA合成时，Random 6 mers的使用量为1～2 μl；2 kb以上的cDNA 合成时，Random 6 mers的使用量为0.4～1 μl也可使用Gene Specific Primer，此时，其在回响体系中的终浓度为0.1 μM （注：上述处理可使模板RNA变性，提高反转录效率 3．在上述Microtube管中配制以下反转录回响液，总量为20 μl 试剂 上述变性后回响液 5PrimeScript II Buffer RNase Inhibitor （40 U/μl） PrimeScript II RTase（200 U/μl） RNase Free dH2O 4．缓慢混匀。
5. 按以下条件举行反转录回响： （30℃ 10 min） （使用Random 6 mers时） 42℃（～50℃ ）﹡3 30～60 min *3：PrimeScript II RTase对具有繁杂二级布局的模板同样具有良好的延迟性能，通常可在42℃下 举行回响使用特异性下游引物举行反转录时，有时会因错配而产生非特异性扩增此时可将反转录温度升到45～50℃，可能会裁减非特异性扩增 6．95℃ 5 min﹡4（酶失活）后，冰上冷却 *4：举行长片段cDNA扩增时，为了制止1st cDNA链的破损，请举行70℃、15 min的失活回响 使用量 10 μl 4 μl 0.5 μl（20 U） 1 μl（200 U） Up to 20 μl ●RT-PCR回响 1st Strand cDNA合成回响液，可直接作为PCR回响的模板使用，其参与量为PCR回响液量的1/10以下模板参与量会对PCR的扩增效率有影响，建议参照PCR酶的说明书，举行最适模板量的研讨 在RT-PCR回响中，产生非特异性扩增或无扩增产物时，将cDNA合成回响液用RNase H处理可改善PCR扩增处境。
【推举使用的PCR酶】 高扩增效率： 长链PCR扩增： TaKaRa Ex Taq、TaKaRa Ex Taq HS TaKaRa LA Taq、TaKaRa LA Taq HS 高保真PCR扩增： PrimeSTAR HS DNA Polymerase ●RNA样品的制备 本试剂盒是将RNA合成cDNA的试剂盒RNA的纯度会影响cDNA的合成量，而制备RNA的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染因此，在测验中务必采取以下措施：戴一次性明净手套；使用RNA操作专用测验台；在操作过程中制止讲话等等通过以上手段可以防止测验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染 【使用器具】 尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按以下（1）或者（2）方法举行处理 （1）干热灭菌（180℃，60 min） （2）用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时然后在120℃下高压灭菌30分 钟以除去残留的DEPC RNA测验用的器具和仪器建议特意使用，不要用于其它测验 【试剂配制】 用于RNA测验的试剂，需使用干热灭菌（180℃，60 min）或用上述方法举行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可使用RNA测验用的一次性塑料容器），使用的无菌水需用0.1%的DEPC处理后举行高温高压灭菌。
RNA测验用的试剂和无菌水都应专用，制止混用后交错污染 【制备方法】 使用简朴的RNA纯化方法即可获得得志于RT-PCR回响的RNA（只需少量的RNA便可举行RT-PCR回响）但为了保表明验的告成率，建议使用GTC法（异硫氰酸胍法）制备的高纯度RNA 从培养细胞、组织中提取Total RNA时，使用RNAiso Plus（TaKaRa Code: D9108） ●相关制品 【相关试剂盒】 高效率、高灵敏度、长链2 Step RT-PCR试剂盒： PrimeScript RT-PCR Kit（TaKaRa Code: DRR014） 高灵敏度的长链One Step RT-PCR试剂盒： PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2（TaKaRa Code: DRR055） 【相关PCR酶】 高灵敏度、高扩增量的PCR酶： TaKaRa Ex Taq （TaKaRa Code: DRR001） TaKaRa Ex Taq Hot Start Version（TaKaRa Code: DRR006） 长链DNA扩增酶： TaKaRa LA Taq （TaKaRa Code: DRR002） TaKaRa LA Taq Hot Start Version（TaKaRa Code: DRR042） 高保真酶： PrimeSTAR HS DNA Polymerase（TaKaRa Code: DR010） MEMO -5- 宝生物工程（大连）有限公司 TaKaRa Biotechnology (Dalian) Co., Ltd. 辽宁省大连经济技术开发区东北二街19号（116600） No.19 Dongbei 2nd Street, Development Zone, Dalian, China 电 话： 0411-87641681 87641683 传 真： 0411-87619946 87621675 E.mail ： service@ 网 址： V2022.03 — 8 —。