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1、第八章第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术第一节第一节 概述概述一、荧光的基本知识一、荧光的基本知识二、荧光物质二、荧光物质第二节第二节 荧光抗体技术荧光抗体技术一、标本的制作一、标本的制作二、荧光抗体的制备二、荧光抗体的制备三、荧光抗体染色与结果判断三、荧光抗体染色与结果判断四、荧光显微镜的基本结构四、荧光显微镜的基本结构第三节第三节 荧光免疫分析的类型荧光免疫分析的类型一、时间分辨荧光免疫测定一、时间分辨荧光免疫测定二、荧光偏振免疫测定二、荧光偏振免疫测定三、荧光酶免疫测定三、荧光酶免疫测定第四节第四节 荧光免疫技术在医学检验中的应用荧光免疫技术在医学检验中的应用一、荧光抗体技术的应用一、荧光
2、抗体技术的应用二、荧光免疫测定的应用二、荧光免疫测定的应用思考题思考题小结小结第一节第一节 概概 述述荧光荧光（fluorescencefluorescence） 荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。放出能量，称为荧光。 一、荧光的基本知识一、荧光的基本知识发射光谱和激发光谱发射光谱和激发光谱 发射光谱发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度。品发射荧光的强度。激发光谱激发光谱是指固定
3、检测发射波长，用不同波长的激发是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。光激发样品记录的相应的荧光发射强度。 荧光的基本知识荧光的基本知识荧光效率荧光效率定义定义: :荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率计算公式计算公式: : 荧光效率荧光效率= = 荧光的基本知识荧光的基本知识荧光寿命荧光寿命定义定义: :荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。度时所用的时间。各种荧光物质的荧光寿命不同。各种荧光物质的荧光寿命不同。 荧光的基本知识荧光的基本知识荧光淬灭荧光淬灭 定义定
4、义: :荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高（消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高（2020）、苯胺、）、苯胺、酚、硝基苯、酚、硝基苯、I I- -等等 。荧光的基本知识荧光的基本知识荧光偏振荧光偏振 FHFL PFHFL荧光的基本知识荧光的基本知识荧光物质荧光物质最大吸收光谱最大吸收光谱最大发射光谱最大发射光谱应用应用异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素 (FITC)(FITC)490490495nm495nm520520530nm 530nm （黄绿色）（黄绿色） FATFAT、荧光偏振免疫测定、荧光偏振免疫测
5、定四乙基罗丹明四乙基罗丹明 (RB200)(RB200)570570575nm575nm595595600nm600nm（橙红色）（橙红色）FITCFITC的衬比染色或双标的衬比染色或双标记记FATFAT四甲基异硫氰酸罗丹四甲基异硫氰酸罗丹明明 (TRITC) (TRITC)550nm550nm620nm620nm（橙红色）（橙红色）FITCFITC的衬比染色或双标的衬比染色或双标记记FATFAT藻红蛋白（藻红蛋白（PEPE）490-560nm490-560nm595nm595nm（红色）（红色）双标记双标记FATFAT、流式细胞术、流式细胞术7-7-氨基氨基-4-4-甲基香豆素甲基香豆素35
6、4nm354nm430nm430nm（蓝色）（蓝色）双标记或多标记双标记或多标记FATFATEuEu3+3+螯合物螯合物340nm340nm613nm613nm时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定荧光物质荧光物质是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。 常用的荧光物质常用的荧光物质 二、荧光物质二、荧光物质第二第二节节 荧光抗体技术荧光抗体技术荧光抗体技术的基本原理荧光抗体技术的基本原理 荧光素标记抗体与切片中组织细胞抗原反应，洗荧光素标记抗体与切片中组织细胞抗原反应，洗涤分离后荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗体复涤分离后荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其部位，对组织细胞抗
7、原进行定性和定位检测，合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对自身抗体进行定性和滴度测定。或对自身抗体进行定性和滴度测定。荧光抗体技术的内容荧光抗体技术的内容 荧光抗体制备荧光抗体制备 标本制作标本制作 荧光抗体染色荧光抗体染色 荧光显微镜检查荧光显微镜检查抗体要求抗体要求 高特异性高特异性 高亲和力高亲和力 经纯化提取经纯化提取IgGIgG 一、荧光抗体的制备一、荧光抗体的制备v有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。v荧光效率高，与
8、蛋白质结合后，仍保持较高的荧光效率。荧光效率高，与蛋白质结合后，仍保持较高的荧光效率。v荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。v与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。v标记方法简单、安全无毒。标记方法简单、安全无毒。v与蛋白质的结合物稳定，易于保存。与蛋白质的结合物稳定，易于保存。荧光素要求荧光素要求荧光抗体的制备荧光抗体的制备抗体的荧光素标抗体的荧光素标记记v标标记记原原理理: :利利用用抗抗体体蛋蛋白白的的自自由由氨氨基基与与FITCFITC的的异异硫硫氰氰基基在在碱碱性性溶溶液液中形成硫碳酰胺键，使抗
9、体与中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITCFITC结合成荧光抗体。结合成荧光抗体。v标记方法标记方法: : 搅拌法：搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间 短，荧光素用量少，但有非特异性染色。短，荧光素用量少，但有非特异性染色。 透析法：透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀，适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀， 非特异染色较低。非特异染色较低。荧光抗体的制备荧光抗体的制备v去除游离荧光素及其降解产物：去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤透析或凝胶过滤v去除荧光素未结合和结合过度的抗体：去除荧光素未结合
10、和结合过度的抗体：阴离子交换层析法阴离子交换层析法v去除交叉反应或非期望抗体：去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收动物肝粉吸收或固相抗原吸收荧光抗体的纯化荧光抗体的纯化荧光抗体的制备荧光抗体的制备v荧光素与蛋白结合率：荧光素与蛋白结合率： F/P=F/P=v抗体效价：抗体效价：双向免疫扩散试验双向免疫扩散试验v抗体特异性：抗体特异性：吸收试验、抑制试验吸收试验、抑制试验v抗体抗体特异性染色滴度：抗体抗体特异性染色滴度：倍比稀释倍比稀释荧光抗体的鉴定荧光抗体的鉴定荧光抗体的制备荧光抗体的制备v-20-20：保存保存1 12 2年年v真空干燥：真空干燥：长期保存长期保存荧光抗体的保
11、存荧光抗体的保存荧光抗体的制备荧光抗体的制备组织切片：组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用）冷冻切片、石蜡切片（最常用）印片：印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织肝、脾、淋巴结等器官或组织 涂片：涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液培养细胞：培养细胞：单层培养细胞单层培养细胞标本的类型标本的类型二、标本的制作二、标本的制作冷冻切片：冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清晰。操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清晰。 石蜡切片：石蜡切片：组织细胞结构显现清楚，抗原损失多。组织细胞结构显现清楚，抗原损失多。组织切片的类型组织切片的类型标本的制作标
12、本的制作固定剂：固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等 保保 存：存：44、-20-20标本标本的固定和保存的固定和保存标本的制作标本的制作直接法直接法直接荧光抗体染色法示意图直接荧光抗体染色法示意图 荧光素标记的特异荧光素标记的特异性抗体直接与相应性抗体直接与相应抗原反应。抗原反应。三、荧光抗体染色及结果判断三、荧光抗体染色及结果判断间接法间接法特异性抗体与相应抗特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记原反应，荧光素标记的抗抗体再与第一抗的抗抗体再与第一抗体结合。体结合。 间接荧光抗体染色法示意图间接荧光抗体染色法示意图 荧光抗体染色及结果判断双标记法双标记法 两种荧光素分别标
13、记的两种不同的特异性抗体，两种荧光素分别标记的两种不同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜色荧光。与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜色荧光。荧光抗体染色及结果判断荧光抗体染色及结果判断 设立实验对照设立实验对照: :阳性对照和阴性对照阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布阳性细胞显色分布: :胞质型、胞核型和膜表面型胞质型、胞核型和膜表面型荧光抗体染色结果判断荧光抗体染色结果判断荧光抗体染色及结果判断荧光抗体染色及结果判断 “-”“-”：无或仅见极微弱荧光。无或仅见极微弱荧光。 “+”“+”：荧光较弱但清楚可见。荧光较弱但清楚可见。 “+
14、” “+”：荧光明亮。荧光明亮。 “+” “+”：耀眼强荧光。耀眼强荧光。特异荧光强度特异荧光强度“+”“+”以上判定为阳性，对照光应呈以上判定为阳性，对照光应呈“-”“-”或或“”“”。根据呈根据呈+的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。 荧光抗体染色结果判断荧光抗体染色结果判断荧光抗体染色及结果判断荧光抗体染色及结果判断荧光显微镜荧光显微镜 利用一定波长的激发光对利用一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长样品进行激发，产生一定波长的荧光，对样品结构或其组分的荧光，对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检进行定性、定位、定量观察检测。测。 四、荧光
15、显微镜的基本结构四、荧光显微镜的基本结构光源：光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯高压汞灯、氙灯或卤素灯 滤光片：滤光片：隔热、激发和吸收滤光片隔热、激发和吸收滤光片光路：光路：透射光、落射光透射光、落射光聚光器：聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器明视野、暗视野和相差荧光聚光器镜头：镜头：消色差镜头消色差镜头 荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜的基本结构荧光显微镜的基本结构隔热滤光片：隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。阻断红外线通过而隔热。 激发滤光片：激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长 的光域，提供合适的激发光。的光域，提供合
16、适的激发光。 吸收滤光片：吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过，位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过，保护眼睛。保护眼睛。荧光显微镜荧光显微镜滤光片滤光片荧光显微镜的基本结构荧光显微镜的基本结构透射光：透射光：照明光线从标照明光线从标本下经聚光器透过标本本下经聚光器透过标本进入物镜。进入物镜。落射光：落射光：照明光线从标照明光线从标本上经垂直照明器落射本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进到标本，经标本反射进入物镜。入物镜。透射荧光显微镜光路透射荧光显微镜光路(a)(a)落射荧光显微镜光路落射荧光显微镜光路(b)(b)荧光显微镜荧光显微镜光路光路荧光显微镜的基本结构荧光显微镜的基本结构第三第三节节 荧光免疫分析的类型荧光免疫分析的类型荧光免疫分析的基本原理荧光免疫分析的基本原理 将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。定量测定。荧光抗体技术荧
