第三章第三章 植物愈伤组织的诱导与分化培养植物愈伤组织的诱导与分化培养 1第一节、植物愈伤组织诱导与继代培养第一节、植物愈伤组织诱导与继代培养第二节、愈伤组织分化与植株再生第二节、愈伤组织分化与植株再生第三节、试管苗的移栽与护理第三节、试管苗的移栽与护理本章主要内容本章主要内容第三章第三章2本章教学目的与要求掌握愈伤组织、外植体、脱分化、再分化、悬浮培养、器官发生、掌握愈伤组织、外植体、脱分化、再分化、悬浮培养、器官发生、体细胞胚胎发生的概念体细胞胚胎发生的概念掌握愈伤组织形成的三个时期的特点掌握愈伤组织形成的三个时期的特点了解了解胚性愈伤与非胚性愈伤识别的区别胚性愈伤与非胚性愈伤识别的区别掌握植株再生的两种方式的区别掌握植株再生的两种方式的区别掌握体细胞胚与合子胚、生殖细胞胚的区别掌握体细胞胚与合子胚、生殖细胞胚的区别第三章第三章3第一节第一节 愈伤组织的诱导与继代培养愈伤组织的诱导与继代培养一、愈伤组织的诱导一、愈伤组织的诱导二、继代培养二、继代培养三、悬浮培养三、悬浮培养第三章第三章4几个重要的概念几个重要的概念植物细胞的全能性：植物细胞的全能性：植物的每个细胞都具有该植物的全植物的每个细胞都具有该植物的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。
部遗传信息和发育成完整植株的能力全能性实现的两个必须满足的条件：全能性实现的两个必须满足的条件：脱离母体组织脱离母体组织要给予植物细胞一定的刺激要给予植物细胞一定的刺激第一节第一节 愈伤组织的诱导和继代培养愈伤组织的诱导和继代培养5外植体（外植体（explantexplant):):植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料，可以是器植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料，可以是器 官、组官、组织、细胞和原生质体等织、细胞和原生质体等根据外植体的不同，组织培养可分为植株培养、胚胎培养、器官培根据外植体的不同，组织培养可分为植株培养、胚胎培养、器官培养养( (如植物的根、茎、叶、花药、子房、胚珠、胚等如植物的根、茎、叶、花药、子房、胚珠、胚等) )、组织培养、组织培养（含愈伤组织）、原生体培养等（含愈伤组织）、原生体培养等第一节愈伤组织的诱导和继代培养第一节愈伤组织的诱导和继代培养6胚乳胚乳原生质体原生质体芽芽胚轴胚轴胚胚种子种子果实果实花器花器叶叶茎茎根根组织组织子叶子叶子房子房苞片苞片胚珠胚珠花药花药花梗花梗分生组织分生组织成熟组织成熟组织花托花托叶柄叶柄幼苗幼苗花粉花粉7脱分化（脱分化（dedifferentiationdedifferentiation）：）：使已分化的体细胞，在人工诱导的条件下回复到未分化的原始状态使已分化的体细胞，在人工诱导的条件下回复到未分化的原始状态并具有细胞全能性表达潜力的过程并具有细胞全能性表达潜力的过程再分化（再分化（redifferentiationredifferentiation）：）：处于脱分化状态的愈伤组织，再度分化成其他类型的细胞、组织、处于脱分化状态的愈伤组织，再度分化成其他类型的细胞、组织、器官，甚至最终再生成完整植株的过程器官，甚至最终再生成完整植株的过程第一节愈伤组织的诱导和继代培养第一节愈伤组织的诱导和继代培养8愈伤组织愈伤组织calluscallus: : 是指将植物上的某个部分切下，形成外植体，是指将植物上的某个部分切下，形成外植体，接种到适宜的培养基上培养，其外植体组织的增生细胞产生的一团接种到适宜的培养基上培养，其外植体组织的增生细胞产生的一团不定形的疏松排列的薄壁组织不定形的疏松排列的薄壁组织植物愈伤组织诱导植物愈伤组织诱导(callus inducing)(callus inducing)：使那些已分化的体细胞包使那些已分化的体细胞包括离体的器官、组织和细胞在人工培养基上，经多次细胞分裂而失括离体的器官、组织和细胞在人工培养基上，经多次细胞分裂而失去原来的分化状态，形成无结构的愈伤组织或细胞团的过程去原来的分化状态，形成无结构的愈伤组织或细胞团的过程第一节愈伤组织的诱导和继代培养第一节愈伤组织的诱导和继代培养一、愈伤组织的诱导一、愈伤组织的诱导9从从外外植植体体脱脱分分化化形形成成典典型型的的愈愈伤组织大致可分为三个时期：伤组织大致可分为三个时期：诱导期诱导期分裂期分裂期形成期形成期1 1、愈伤组织诱导的、愈伤组织诱导的3 3个时期：个时期：第一节愈伤组织的诱导和继代培养第一节愈伤组织的诱导和继代培养10Stage 1. Induction（诱导期诱导期）: 第一节愈伤组织的诱导和继代培养第一节愈伤组织的诱导和继代培养细胞准备进行分裂的时期，是愈伤组织形成起点细胞准备进行分裂的时期，是愈伤组织形成起点机械损伤机械损伤就是引起诱导组织细胞分裂的一种刺激因素就是引起诱导组织细胞分裂的一种刺激因素外源激素外源激素也是一种能诱导细胞开始分裂的诱导剂也是一种能诱导细胞开始分裂的诱导剂 11诱导期细胞内发生的变化诱导期细胞内发生的变化气体交换增加，如氧气的吸收增加气体交换增加，如氧气的吸收增加RNARNA含量增加（增加到含量增加（增加到300%300%）蛋白质量增加（每个细胞的总增加量为蛋白质量增加（每个细胞的总增加量为200%200%）酶活性增强酶活性增强第一节愈伤组织的诱导和继代培养第一节愈伤组织的诱导和继代培养12Stage 2. Cell divisionStage 2. Cell division（分裂期）（分裂期）外植体细胞经诱导脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程外植体细胞经诱导脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程第一节愈伤组织的诱导和继代培养第一节愈伤组织的诱导和继代培养13细胞的数目迅速增加细胞的数目迅速增加, ,每个细胞平均鲜重下降每个细胞平均鲜重下降细胞体积小，内无液泡细胞体积小，内无液泡细胞的核和核仁增大到最大细胞的核和核仁增大到最大细胞中细胞中RNARNA含量减少，而含量减少，而DNADNA含量保持不变含量保持不变随随着着细细胞胞不不断断分分裂裂和和生生长长，细细胞胞总总干干重重、蛋蛋白白质质和和核核酸酸量大大增加，新细胞壁合成极快量大大增加，新细胞壁合成极快分裂期细胞的主要表现分裂期细胞的主要表现: :第一节愈伤组织的诱导和继代培养第一节愈伤组织的诱导和继代培养14细细胞胞分分裂裂快快，结结构构疏疏松松，缺缺少少有有组组织织的的结结构构，维维持持其其不不分分化化的的状状态，颜色浅而透明。
态，颜色浅而透明1mg/l 2,4-D10mg/l 2,4-D分裂期愈伤组织的共同特征：分裂期愈伤组织的共同特征：第一节愈伤组织的诱导和继代培养第一节愈伤组织的诱导和继代培养15Stage 3. DifferentiationStage 3. Differentiation（形成期）（形成期）指外植体的细胞经过诱导、分裂形指外植体的细胞经过诱导、分裂形成了具有无序结构的愈伤组织时期成了具有无序结构的愈伤组织时期第一节愈伤组织的诱导和继代培养第一节愈伤组织的诱导和继代培养16u细胞大小不再发生变化细胞大小不再发生变化u细胞分裂部位和方向发生改变，以平周分裂为主细胞分裂部位和方向发生改变，以平周分裂为主u出现瘤状或片状的分生组织结构，形成出现瘤状或片状的分生组织结构，形成“泡状泡状”增殖状态增殖状态u出出现现了了各各种种类类型型的的细细胞胞：如如管管胞胞、纤纤维维细细胞胞、薄薄壁壁细细胞胞、分分生生细胞、色素细胞等细胞、色素细胞等u生生长长旺旺盛盛的的愈愈伤伤组组织织呈呈乳乳白白色色、白白色色或或浅浅绿绿色色，老老化化的的多多转转化化为黄色或褐色为黄色或褐色形成期细胞特点：形成期细胞特点：第一节愈伤组织的诱导和继代培养第一节愈伤组织的诱导和继代培养172 2、愈伤组织的形态和细胞学特征愈伤组织的形态和细胞学特征根据组织学观察、外观特征及其再生性、再生方式等，愈伤组织分根据组织学观察、外观特征及其再生性、再生方式等，愈伤组织分成两大类：成两大类：胚性愈伤组织胚性愈伤组织（embryonic callusembryonic callus，ECEC）和）和非胚性愈伤非胚性愈伤组织组织（non-embryonic callusnon-embryonic callus，NECNEC）。
愈伤组织在长期的培养中能够形成分生组织区、管胞和色素细胞，愈伤组织在长期的培养中能够形成分生组织区、管胞和色素细胞，或者形成体细胞胚，这种能够形成体细胞胚的愈伤组织叫做或者形成体细胞胚，这种能够形成体细胞胚的愈伤组织叫做胚性愈胚性愈伤组织伤组织( (embryogenicembryogenic callus) callus) 第一节愈伤组织的诱导和继代培养第一节愈伤组织的诱导和继代培养18非胚性愈伤组织：非胚性愈伤组织：不同材料和诱导条件下表现不同，颜色有白色、不同材料和诱导条件下表现不同，颜色有白色、绿色、黄绿色，质地疏松，水渍状，增殖快；有的成硬块，增殖慢绿色、黄绿色，质地疏松，水渍状，增殖快；有的成硬块，增殖慢胚性愈伤组织：胚性愈伤组织：质地较坚实，颜色有乳白色、淡黄绿色或黄色，米质地较坚实，颜色有乳白色、淡黄绿色或黄色，米粒状、表面光滑、疏松结构的组织粒状、表面光滑、疏松结构的组织 第一节愈伤组织的诱导和继代培养第一节愈伤组织的诱导和继代培养HIA19第一节愈伤组织的诱导和继代培养第一节愈伤组织的诱导和继代培养胚性愈伤组织由大小一致的球状或近球状细胞构成，细胞较小，细胞核大、原生胚性愈伤组织由大小一致的球状或近球状细胞构成，细胞较小，细胞核大、原生质浓厚，无液泡，常富含淀粉粒，分裂活性强。
质浓厚，无液泡，常富含淀粉粒，分裂活性强非胚性愈伤组织细胞形状不规则，不均匀，有长柱形、椭圆形等，细胞较大，细非胚性愈伤组织细胞形状不规则，不均匀，有长柱形、椭圆形等，细胞较大，细胞核小，有大液泡，含少量原生质胞核小，有大液泡，含少量原生质细胞学特征：细胞学特征：201 1、继代培养继代培养：愈伤组织培养一段时间后必须转移到新鲜培养基上以保持：愈伤组织培养一段时间后必须转移到新鲜培养基上以保持培养物的继续正常生长，更换一次培养基称一次继代培养培养物的继续正常生长，更换一次培养基称一次继代培养(subculture)(subculture)为什么要继代培养为什么要继代培养？补充养分补充养分避免毒害避免毒害增殖、分化的需要增殖、分化的需要二、愈伤组织的继代培养二、愈伤组织的继代培养第一节愈伤组织的诱导和继代培养第一节愈伤组织的诱导和继代培养212 2、继代频率、继代频率: : 取决于愈伤组织的生长速度一般情况下，在愈伤组织生长取决于愈伤组织的生长速度一般情况下，在愈伤组织生长到直径到直径2 23cm3cm时才将其与外植体分离，时才将其与外植体分离，4 46 6周周继代一次继代一次3 3、方法、方法: : 从单细胞产生的愈伤组织，同样可以采用分割愈伤组织块转从单细胞产生的愈伤组织，同样可以采用分割愈伤组织块转移到新鲜培养基上的方法进行反复继代培养。
移到新鲜培养基上的方法进行反复继代培养第一节愈伤组织的诱导和继代培养第一节愈伤组织的诱导和继代培养I22悬浮培养悬浮培养(suspension culture):(suspension culture):把游离的植物细胞或小块生长把游离的植物细胞或小块生长旺盛的愈伤组织放入液体培养基中，进行振荡培养，从而使愈伤旺盛的愈伤组织放入液体培养基中，进行振荡培养，从而使愈伤组织块变成良好分散性的细胞和小的细胞聚集体组织块变成良好分散性的细胞和小的细胞聚集体第一节愈伤组织的诱导和继代培养第一节愈伤组织的诱导和继代培养三、三、 悬浮培养悬浮培养231 1、悬浮培养的、悬浮培养的用途用途(1) (1) 提供相对一致的细胞群体提供相对一致的细胞群体（供生化、胚胎发生、胚的同步化研究等（供生化、胚胎发生、胚的同步化研究等) )(2) (2) 原生质体的良好细胞来源原生质体的良好细胞来源(3) (3) 突变体筛选突变体筛选(4) (4) 次生代谢物质的生产次生代谢物质的生产第一节愈伤组织的诱导。