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1、第五章第五章 固相析出分离法固相析出分离法 通过改变溶液条件，使溶质以固体形式从溶液中分出的操作技术。 盐析法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法 结晶法2第一节第一节 盐析法盐析法 ( (saltprecipitation)saltprecipitation)定义：盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。优点：简单、经济、较少变性缺点：分辨率不高，要除盐3一、基本原理一、基本原理5原理原理 形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，排斥作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。 中性盐的亲水性比蛋白质大，使蛋白质脱去了水化
2、膜，使其沉淀。6在盐析区，符合公式在盐析区，符合公式logS=-Ks S蛋白质溶解度，g/L；盐离子强度, Cii离子浓度，mol/L；Zii离子化合价；常数,为纵坐标上的截距;Ks盐析常数。7、 KS 为纵坐标上的截距，为纵坐标上的截距，是外推截距，与无机，与无机盐种类无关。盐种类无关。 KS是盐析常数，与蛋白质和盐的种类有关，与蛋白质和盐的种类有关，但与温度和但与温度和pHpH无关。无关。 两种类型：两种类型：（1 1）在一定的）在一定的pHpH和温度下改变离子强度（盐和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析，称作浓度）进行盐析，称作Ks盐析法。（2 2）在一定离子强度下仅改变）在一定离子强
3、度下仅改变pHpH和温度进行和温度进行盐析，称作盐析，称作盐析法。8（一）、无机盐的种类 盐析能力：半径小的高价离子在盐析时的作用较强，阴离子的盐析效果比阳离子好，尤其以高价阴离子更为明显。PO43-SO42CH3COOClNO3INH4+K+Na+Li+ 盐析用盐常用硫酸铵9二、影响盐析的因素二、影响盐析的因素( (二）溶质（蛋白质等）种类的影响二）溶质（蛋白质等）种类的影响10盐析分布曲线盐析分布曲线11（三）蛋白质浓度的影响（三）蛋白质浓度的影响12蛋白质浓度蛋白质浓度提高，盐用提高，盐用量减少。量减少。 碳氧肌红蛋白（四）温度的影响（四）温度的影响13温度的变化会影响值在无盐或稀盐溶液
4、中，大多数蛋白质溶解度是随温度升高而增大的，但在高盐溶液中常相反（五）（五）pHpH的影响的影响 当溶液的当溶液的pHpH在蛋白质在蛋白质等电点附近时，等电点附近时， 值最值最小。小。 利用利用 值最低点时值最低点时pHpH的的不同，可以分级沉淀不同，可以分级沉淀蛋白质蛋白质. . 14三、盐析操作三、盐析操作 （一）盐析用盐的浓度表示（一）盐析用盐的浓度表示 固体粉末固体粉末 硫酸铵饱和溶液硫酸铵饱和溶液 常用常用“ “饱和度饱和度” ”来表征硫酸铵在溶液中来表征硫酸铵在溶液中的最终浓度，的最终浓度，2525时时(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4的饱和浓的饱和浓度为度为4.1 mo
5、l4.1 molL L，定义它为，定义它为100%100%饱和度饱和度. .15（二）盐析方法和注意事项（二）盐析方法和注意事项 1 1、分部盐析法分部盐析法2 2、重复盐析法、重复盐析法 3 3、反抽提法反抽提法 一定的盐浓度下将一定的盐浓度下将目的蛋白夹带一定量目的蛋白夹带一定量的杂蛋白一同沉淀的杂蛋白一同沉淀。 将沉淀用较低浓度将沉淀用较低浓度盐溶液平衡，溶出其中的杂蛋白。盐溶液平衡，溶出其中的杂蛋白。 16分部盐析法分部盐析法17反抽提法反抽提法(RNA(RNA聚合酶聚合酶) )18注意事项注意事项 “ “局部过浓局部过浓” ” 温度温度 （室温）（室温） 分离方法分离方法 19第二节
6、第二节 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀(Organic Solvent Precipitation)(Organic Solvent Precipitation) 定义：向水溶液中加入一定量定义：向水溶液中加入一定量亲水性亲水性的的有机溶剂，降低溶质的有机溶剂，降低溶质的溶解度溶解度，使其沉，使其沉淀析出的分离纯化方法。淀析出的分离纯化方法。201 1、降低了介质的、降低了介质的介电常数介电常数，使溶质分子，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。 2 2、水溶性有机溶剂本身的、水溶性有机溶剂本身的水合作用水合作用降低降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分了自由水的
7、浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有子表面原有水化层的厚度水化层的厚度，降低了它，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。的亲水性，导致脱水凝集。 21一、基本原理一些溶剂的介电常数一些溶剂的介电常数 22有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 优点：优点： 乙醇等有机溶剂易除去，产品更纯净乙醇等有机溶剂易除去，产品更纯净；密度差较大，离心收集。；密度差较大，离心收集。 缺点：缺点： 容易使蛋白质变性，操作常需低温，容易使蛋白质变性，操作常需低温，成本高，需成本高，需防火防爆防火防爆。23二、影响沉淀效果的因素二、影响沉淀效果的因素 （一）有机溶剂种类及用量 常用的溶剂有乙醇、丙酮、甲醇等。 （二）pH的影响 许多
8、蛋白质在等电点附近时溶解度最低，溶液pH应在等电点附近，还须考虑蛋白质的稳定性。 24（三）温度（低温沉淀） 有机溶剂存在下，大多数蛋白质的溶解度随温度降低而显著地减小。（四）无机盐的含量 低盐：有利于沉淀，还有保护蛋白质，防止变性。 高盐：增大蛋白质在有机溶剂水溶液中的溶解度，沉淀物中可能夹带盐。 25 多价阳离子，如多价阳离子，如CaCa2+2+、ZnZn2+2+能与蛋白质结合能与蛋白质结合形成复合物，使蛋白质溶解度降低。形成复合物，使蛋白质溶解度降低。 胰岛素精制：胰岛素精制： 26（五）某些金属离子的助沉淀作用（六）样品浓度 浓度小时，增加溶剂投入量和损耗。浓度小时，增加溶剂投入量和损
9、耗。 浓度大时，增加共沉作用，降低分辨率。浓度大时，增加共沉作用，降低分辨率。 蛋白质浓度蛋白质浓度0.5%0.5%2%2%； 粘多糖浓度粘多糖浓度1%1%2%2%。27第三节第三节 其它沉淀方法其它沉淀方法 一、等电点沉淀法一、等电点沉淀法 对于两性物质，等电点时对于两性物质，等电点时净电荷为零，净电荷为零，分子间排斥分子间排斥电位降低电位降低，吸引力增大，吸引力增大，能相互聚集起来，发生沉能相互聚集起来，发生沉淀。淀。 28 胰岛素纯化：胰岛素纯化：胰岛素胰岛素pH8pH8除去碱性杂蛋白除去碱性杂蛋白pH3pH3除去酸性杂蛋白除去酸性杂蛋白金属离子沉淀：与生物分子的金属离子沉淀：与生物分子
10、的酸性功能酸性功能团团作用的作用的金属复合盐法金属复合盐法；有机酸类复合盐沉淀有机酸类复合盐沉淀: :与生物分子的与生物分子的碱性碱性功能团功能团作用的作用的有机酸复合盐法有机酸复合盐法（如苦（如苦味酸盐、苦酮酸盐、丹宁酸盐等）。味酸盐、苦酮酸盐、丹宁酸盐等）。29二、成盐沉淀法 1 1金属离子沉淀：金属离子沉淀： MnMn2+2+、FeFe2+2+、CoCo2+2+、NiNi2+2+、ZnZn2+2+、CaCa2+2+、BaBa2+2+、MgMg2+2+等；等； 2 2生成有机酸类复合盐沉淀生成有机酸类复合盐沉淀（1 1）丹宁即鞣酸）丹宁即鞣酸 （2 2）雷凡诺雷凡诺 （3 3）三氯乙酸三氯
11、乙酸（TCATCA）30雷凡诺雷凡诺 31猪心提取液猪心提取液 洗脱液洗脱液 上清液上清液 上清上清 细胞色素细胞色素C C 沉淀（去除）沉淀（去除）32吸附人造沸石盐析45%饱和硫酸铵沉淀TCA透析猪心中提取细胞色素C的工艺三、亲和沉淀三、亲和沉淀 利用亲和反应原理，将配利用亲和反应原理，将配基与可溶性的载体偶联后基与可溶性的载体偶联后形成形成载体载体- -配基复合物（配基复合物（亲和沉淀剂）亲和沉淀剂），该复合物，该复合物可选择性地与蛋白质结合可选择性地与蛋白质结合，在一定条件下沉淀出来，在一定条件下沉淀出来。 33 34胰蛋白酶提取工艺四、四、高分子聚合物沉淀高分子聚合物沉淀 水溶性非离
12、子型高分子聚合物，如不同水溶性非离子型高分子聚合物，如不同分子量的聚乙二醇（分子量的聚乙二醇（PEGPEG）、葡聚糖、）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯等，能使右旋糖苷硫酸酯等，能使蛋白质水合作蛋白质水合作用减弱而发生沉淀用减弱而发生沉淀。五、表面活性剂五、表面活性剂 十六烷基三甲基季胺溴化物（十六烷基三甲基季胺溴化物（CTABCTAB） 十六烷基氯化吡啶（十六烷基氯化吡啶（CPCCPC）35酸性多糖36六、选择性变性沉淀法六、选择性变性沉淀法 热变性沉淀法热变性沉淀法 酸碱变性沉淀法酸碱变性沉淀法 利用试剂（氯仿）利用试剂（氯仿）37第四节第四节 结晶结晶(crystallization)(crys
13、tallization) 定义：定义：溶液中的溶质在一定条件下因分溶液中的溶质在一定条件下因分子有规则的排列而结合成晶体。子有规则的排列而结合成晶体。 通过结晶，溶液中的大部分杂质会留在通过结晶，溶液中的大部分杂质会留在母液中，经过滤、洗涤可得到母液中，经过滤、洗涤可得到纯度高纯度高的的晶体。晶体。 38一、结晶过程一、结晶过程指溶质质自动动从过饱过饱 和溶液中析出形成新相的过过程。 C2 小晶体的溶解度；C1 普通晶体的溶解度； 晶体密度；M 晶体质量； 晶体与溶液间的界面张力； 2 小晶体的半径； 1 普通晶体的半径；39结晶包括三个过程：结晶包括三个过程：(1) (1) 形成形成过饱和溶
14、液过饱和溶液; ;(2) (2) 晶核形成晶核形成; ;(3) (3) 晶体生长。晶体生长。40浓度温度图浓度温度图41二、过饱和溶液的形成二、过饱和溶液的形成( (结晶方结晶方法法) )（一）、蒸发法（一）、蒸发法 （二）、（二）、温度诱导法温度诱导法（三）、（三）、盐析结晶法盐析结晶法（四）、（四）、透析结晶法透析结晶法（五）、有机溶剂结晶法（五）、有机溶剂结晶法 42温度诱导法温度诱导法43盐析结晶法盐析结晶法44透析结晶法透析结晶法45（六）、（六）、等电点法等电点法（七）、微量扩散法（七）、微量扩散法 （八）、（八）、化学反应结晶法化学反应结晶法 调节溶液的调节溶液的pHpH或向溶液
15、中加入或向溶液中加入反应剂反应剂，生成新物质，结晶析出。生成新物质，结晶析出。 （九）、共沸蒸馏结晶（九）、共沸蒸馏结晶 46等电点法等电点法47化学反应结晶法化学反应结晶法48综合利用综合利用49三、提高晶体质量的途径三、提高晶体质量的途径 工业上通常希望得到工业上通常希望得到粗大而均匀粗大而均匀的晶体的晶体，便于过滤与洗涤。，便于过滤与洗涤。（一）、晶体大小（一）、晶体大小 影晶体大小的主要因素有影晶体大小的主要因素有过饱和度、温过饱和度、温度、搅拌速度、晶种度、搅拌速度、晶种等。等。 50（二）、晶体形状 改变晶体外形，可用:选择不同的溶剂、控制过饱和度、结晶温度、调节溶液的pH和有目的
16、地加入某种能改变晶形的杂质等。 （三）、晶体纯度 晶体表面具有一定的物理吸附能力。 重结晶：即将晶体用合适的溶剂剂溶解再次结结晶。51重结晶重结晶(recrystallization)(recrystallization) 溶解度受温度影响较大的物质，将溶解度受温度影响较大的物质，将产品溶解在产品溶解在热的溶剂热的溶剂中，缓慢降低中，缓慢降低温度析出晶体。温度析出晶体。 将溶质溶于一种溶剂中，然后将第将溶质溶于一种溶剂中，然后将第二种溶剂加热后缓缓地加入，放置二种溶剂加热后缓缓地加入，放置一段时间使结晶完全一段时间使结晶完全 。52红霉素重结晶红霉素重结晶53用于生物物质重结晶的溶剂一般有蒸馏水、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、低级醇等。第六章吸附分离法5455 吸附法(adsorption method)指利用吸附作用，将样品中的生物活性物质或杂质吸附于适当的吸附剂上，利用吸附剂对活性物质和杂质间吸附能力的差异，使目的物和其它物质分离，达到浓缩和提纯目的的方法。 56尿激酶的工艺57优点：(1)设备简单、操作简便、价廉、安全。(2)少用或不用有机溶剂，吸附过程中pH变化小，较少引起生物活性物
