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1、单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式*1Proteomicsn蛋白质组学博学至精 明德至善Proteome&Proteomics定义nProteome：n1994年，由澳大利亚Macguarie大学的Wilkins等首先提出：“蛋白质组指由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部蛋白质”n“proteome”是由蛋白质一词的前几个字母“prote”和基因组一词的后几个字母“ome”拼接而成博学至精 明德至善Proteome&Proteomics定义nProteomics：n蛋白质组学是从整体水平细胞内蛋白质的组成、结构、功能及其动态变化规律的科学。n研究内容包括分析蛋白质组所有组分
2、及它们的表达水平，确定各种组分的空间定位、修饰方法、互作机制、生物活性及相应特定功能等。n由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识博学至精 明德至善博学至精 明德至善Genomics Transcriptomics & Proteomics博学至精 明德至善Proteomics&StructuralGenomics博学至精 明德至善Proteomics&FunctionalGenomics博学至精 明德至善特点之一整体性博学至精 明德至善特点之二系统性博学至精 明德至善特点之三动态性博学至精 明德至善nStructuralProteomicsn结构蛋白质组学nFun
3、ctionalProteomicsn功能蛋白质组学分类博学至精 明德至善StructuralProteomicsnSeparationnIdentificationnPTM(post-translationalmodification)IdentificationnComparison&SubtractionAnalysis博学至精 明德至善FunctionalProteomicsnLocalizationnProteinComplexDeterminationnProtein-ProteinInteraction/InteractionNetworknFunctionofProtein(Me
4、tabolicandRegulatoryPathway;SignalTransductionPathway)博学至精 明德至善n 蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合生物质谱、Western印迹、蛋白质芯片等技术，对蛋白质进行全面的鉴定研究。n 翻译后修饰的鉴定：如磷酸化、糖基化、酶原激活等过程。n 蛋白质功能确定：包括蛋白质定位研究，蛋白质活性，蛋白质相互作用，酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析，配基-受体结合分析等。蛋白质组学的主要任务单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式*15蛋白质组学研究思路与方法n策略、技术、工具博学至精 明德至善主要专业术语及其英文对照和缩
5、写nIPG-IEF：固相pH梯度等电聚焦（immobilizedpHgradientsisoelectricfocusing）nSDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis）n2-DE：双向电泳(TwoDimensionalElectrophoresis)nHPLC：高效液相色谱（HighperformanceLiquidChromatography）nMALDI-TOFMS：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MatrixAssistedLaserDesorption/Ioniz
6、ationTime-of-FlightMassSpectrometry)博学至精 明德至善n蛋白序列数据库（SWISS-PROT/TrEMBL；http:/www.expasy.ch）n基因序列数据库（Genbank，http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/ EMBL； http:/www.ebi.ac.uk/）n蛋白模式数据库（Prosite；http:/www.expasy.ch/sprot/prosite.html）n蛋白质二维凝胶电泳数据库、蛋白三维结构数据库（PDB，http:/www.pdb.bnl.gov/；FSSP，http:/www.embl-ebi.ac.uk
7、）n蛋白翻译后修饰数据库（O-GLYCBASE，http:/www.cbs.dtu.dk/databases/OGLYCBASE）蛋白质组学研究相关数据库博学至精 明德至善研究策略n两条互补的实验流程n基于凝胶的工作流程（Gel-basedworkflow）n基于液相色谱的工作流程（LC-basedworkflow）博学至精 明德至善Classical GE & LC to Protein ID Gapelo (2010) J ProteomicsHPLC-MS博学至精 明德至善博学至精 明德至善蛋白质组研究的主要手段蛋白质组研究的主要手段v双向电泳（two dimensional gel e
8、lectrophoresis, 2D-GE）v差示电泳（differential gel electrophoresis, DIGE ）v毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE) v高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)分子筛柱层析反向柱层析v质谱分析 ( mass spectrometry MS) 基质辅助激光解吸离子化-飞行时间串联质谱(matrix-assisted laser disorption ionization-time of flight /tandem MS , MALDI-TO
9、F/MS/MS) 电喷雾离子化串联质谱（electrosprayionizationESI-MS）v生物信息学博学至精 明德至善蛋白质组学实验室所需的条件博学至精 明德至善蛋白质组学研究的基本技术路线蛋白质样品的制备双向电泳或HPLC图像分析凝胶中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白质质量N端测序肽序列质谱数据肽指纹图数据搜索新的或已知蛋白翻译后修饰的鉴定酶解博学至精 明德至善SampleProteinPreparation1.Usually the complexity of the protein and /or peptide mixture lies beyond the theoretica
10、l separation space of any separation method. 2.Proteome Complexity. Genomic transcription in diversity; post-transcription processing; post-translational modification; constitution of combinatorial complex.3.It requires quite a long time for analysis of protein complex.a)Sample recovery low through
11、separation: more steps, less overall recovery.b)The conc. of the proteins with a range of 6-order magnitude : in tissues, protein concentrations span a dynamic range of six orders of magnitudes (for regulatory protein or TFs a few molecules per cell, for housekeeping proteins million copies per cell
12、). So, it is difficult to detect very low concentrated proteins in the presence of highly abundant proteins .c)The complex protein samples with limited stability due to existence of enzymes and proteases, enzyme inhibitors can only partly stabilize the sample.博学至精 明德至善4.Many parameters influence the
13、 composition of proteome between induced and inherent biological variations, such as genetic differences, gender and age of patients and cell growth conditions. This requires sample replicates. (statisticians would demand at least five replicates, in many cases three replicates can deliver highly co
14、nfident results. In clinical the number of required proteins are much high) . 5.Membrane proteins are very difficult to solubilize, and easy to loss during sample preparation and separation by sticking to a surface or aggregation. 6.Post-translational modifications (PTMs) like phosphorylation and gl
15、ycosylation require sophisticated analysis tools like MSn, where the peptide ions generated several times fragmented. SampleProteinPreparation博学至精 明德至善蛋白质组研究的基本技术-样品预分离n样品的制备（预处理）：n组织n细胞n细胞器（线粒体、叶绿体、细胞核）博学至精 明德至善蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取n重要性：n在制备时丢失的蛋白永远不能在后面实验中弥补n原则：n使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态n防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀n防
16、止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）n完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白博学至精 明德至善蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取n步骤：n破碎n沉淀蛋白n去除杂质博学至精 明德至善蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取n样品制备流程-破碎尽可能减少蛋白水解/其它形式蛋白降解原则n机械法（超声波法、高压法、机械匀浆法）n化学法（去污剂法、酶裂解法）n物理法（液氮研磨法、反复冻融法、渗透法、玻璃珠破碎法）博学至精 明德至善蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取n样品制备流程-沉淀蛋白去杂浓缩后蛋白可溶性是关键n三氯醋酸（TCA）-丙酮沉淀法nTCA沉淀法引起降解/修饰n丙酮沉淀法n硫酸铵沉淀法影响IEFn醋酸铵沉淀法步骤繁琐博学至精 明德至善2D电泳结果影响因素分析博学至精 明德至善蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取n样品制备流程-去除杂质关键是尽量不丢失蛋白和减少蛋白修饰n核酸的清除（DNase/RNase）n多糖的清除（超离心、TCA沉淀等）n去污剂的清除（丙酮沉淀法等）n盐离子和外源带电小分子的清除（透析、TCA-丙酮沉淀法）博学至精 明德至善2D电泳结果影响因素分析可能原
