《蛋白质的表征p知识分享》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质的表征p知识分享（33页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式* * *1 1第一章 蛋白质的表征第一节 蛋白质结构的基本概念 蛋白质是一类重要的生物高分子，英文为“Protein，该词从希腊文转化而来，意思是“最原始的”，可见当时人们对蛋白质的认识已有相当的基础。 蛋白质有成千上万种，不同的蛋白质具有不同的生物功能。蛋白质是20种氨基酸通过酰胺键(肽键)联成的长链分子，这种长链即所谓的肽链。许多蛋白质还包含有非肽链结构的其他组成成分，这种成分称为配基或辅基。 作为蛋白质组成成分的氨基酸一共有20种，它们的名称和结构列在表1.1中。为了表达蛋白质和肽结构的需要，每个氨基酸都有相应的符号表示，常用符号通常由
2、氨基酸英文名的三个字母组成。一个蛋白质由上百个甚至上千个氨基酸组成，为了表达的方便，又设计出单字符号。 除了列出的20种基本氨基酸外，实际上还有几百种不常见的氨基酸参与某些蛋白质的组分，可称为稀有氨基酸；另一些氨基酸出现频率要高些，如羟脯氨酸、甲基组氨酸和甲基赖氨酸、丁羧基谷氨酸等，但它们是在蛋白质生物合成后转变而来的，因此不计入基本氨基酸之列。 从氨基酸的结构看，半胱氨酸的侧链上有巯基(一SH)。巯基的稳定性较差，在碱性pH下易氧化成二硫键。如果一条肽链上的两个半胱氨酸的巯基形成二硫键，肽链形成链内二硫键。假如两条肽链间形成二硫键，就出现由两条肽链组成的蛋白质(如胰岛素)。蛋白质分子有两对以
3、上的二硫键，或者是蛋白质分子有一对二硫键和一个半胱氨酸，二硫键可能有不同的连接方式，于是出现了异构体。异构体的数目因半胱氨酸含量不同而异，但是在天然的蛋白质分子中没有这种异构体，只有一种连接方式。而在重组蛋白质的复性中，可能出现二硫键的错配对。 一级结构是指肽链中的氨基酸排列序列，二硫键的定位也是一级结构的重要内容。 蛋白质的二级结构也可称为构象单元，因为它们是蛋白质复杂的空间构象的基础。一些构象单元的结构不是不可改变的，pH、温度、溶剂极性等环境因素可以影响单元的变化。 具有二级结构的肽链在空间走向，形成具有空间三级结构的蛋白质，如所谓球蛋白类，它们几乎都有生物功能和活性，其中有些还能进一步
4、相互作用，形成更高层次的结构。蛋白质之所以有功能，是因为分子表面有可以进一步作用的基团，不同的蛋白质由于分子表面结构不同，可作用的基团分布和组合也不同，这种特定的结构就是各种蛋白质具有不同的功能和活性的分子基础。 四级结构可以认为是一些特定三级结构的折叠肽链通过非共价键而形成的大分子体系，也可称为亚基的装配(assembly)。装配是一个非常复杂的过程，它能使各亚基间相互调节，使蛋白质分子的功能更完善。 蛋白质的分离纯化是研究蛋白质的基础和起点。蛋白质的来源是多样的，主要来自动物、植物的各种组织和微生物，取材要采用含量丰富的器官。 抽提蛋白质的第一步是将组织粉碎，破坏细胞，以便于抽提出蛋白质；
5、抽提液的选择也因蛋白质而异。一般用低浓度的缓冲液，有时在从肌肉抽提时也用稀碱，因肌肉中含有乳酸，最后抽提液的pH却是中性的。在提取膜蛋白或包含体内的蛋白质时，还加入(非离子型)表面活性剂或变性剂以增加溶解度。各种细胞中普遍存在各种蛋白水解酶，会导致蛋白质的降解，低温操作和加一些相应蛋白酶抑制剂(如DFP、PCMB、PMSF等)、螯合剂(EDTA等)是有益的。 将蛋白质抽提出来后，就要进一步纯化。纯化不外乎两方面：一是将大体积变成小体积；二是把多组分蛋白质只留下单一种的蛋白质。前者有吸附法、超滤法、冻干等。后者有根据蛋白质的分子形状和分子质量大小、电离性质、溶解度和疏水性、生物功能专一性等，常用
6、有各种盐析法、超离心沉降、结晶、电泳、凝胶过滤，离子交换色谱、亲和色谱等。近年来发展的FPLC和HPLC大大促进了许多蛋白质在毫克级的纯化，其量足够用于蛋白质的化学研究。第二节 蛋白质的纯度 蛋白质的纯度是一个重要的指标，尤其在重组蛋白的质量控制中。但它也是一个相对的指标，而纯度要求95、99或99.9需根据实际要求而制定。 蛋白质的纯度一般指是否含有其他杂蛋白，而不包括盐、缓冲液离子、十二烷基硫酸钠(SDS)等小分子在内。一些蛋白质在硫酸铵糊中相当稳定，一些酶在甘油中保存则很稳定。 蛋白质纯度如用百分数表示，有时还和检测方法、定量方法、所选用仪器的参数有关。例如在HPLC分析蛋白质纯度时，一
7、般要求以280nm检测，这是蛋白质的吸收高峰，而很可能不是非蛋白质杂质的紫外吸收峰，甚至小分子物质在280nm处没有吸收，因此都以280nm的光吸收来定量处理，检测不到非蛋白质杂质和小分子物质的存在，表明所得的蛋白质纯度会偏高。 在色谱中普遍采用积分面积的方法，这也不是很妥当的。而且在用计算机或积分仪在线检出时，仪器的参数设置与所得的报告很有关系，设置不妥往往导致结果不够准确。 目前常用的鉴定蛋白质纯度方法有：聚丙烯酰胺凝胶电泳和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)；毛细管电泳(CE)；等电聚焦(IEF)；高效液相色谱(HPLC)，包括凝胶过滤、各种反相色谱、离子色谱、疏水色谱
8、等；质谱(MS)。 一些新的有效方法也在引入分析蛋白质的纯度，如质谱等。由于它测定分子质量的精确度可达万分之一，因此丢失一个氨基酸残基(平均分子质量约110Da)就可以检出；如有氨基酸的取代形成突变株(可能分子质量有几十道尔顿的差异)，也非常容易被发现。 按照严格的要求，用电泳法证明蛋白质的纯度，在一种pH下电泳说明该蛋白质是纯的，这是不够充分的。应该取两种pH缓冲液，它们分布在蛋白质等电点的两侧，在这两种pH下电泳都证明此蛋白质是纯的，这样才可靠。 应该指出，只用一种方法鉴定蛋白质纯度是不够的，至少应该用两种以上的方法，而且是两种不同的分离机理的方法来判断蛋白质纯度才比较可靠。因为常常发现某
9、一样品在凝胶过滤中是纯的，而在离子色谱中却分辨为两个组分，反之亦然。 又如，一种样品用凝胶过滤法和SDSPAGE电泳证明是纯的，但这仍不充分，因为这两种方法的机制是相同的。第三节 蛋白质的定量 测定蛋白质的量是研究蛋白质的最基本的一步，而对蛋白质定量方法的原理、适用范围、灵敏度和可靠性程度有一些了解是必要的。 溶液中蛋白质的浓度测定方法很多，最早的经典方法是克氏定氮法，因为每一种蛋白质都有其恒定的含氮量(1416)。 其方法是将一定量的蛋白质用浓硫酸消化分解，使其中的氮变成铵盐，再与浓NaOH作用，使氨气放出而被吸收于标准酸液中，用反滴定法滴定残余的酸，或用硼酸吸收后，再用标准酸直接滴定，求得
10、该蛋白质样品中的含氮量。 此法虽有普遍性，但操作繁琐，目前应用较少。稍后应用较广泛的方法是双缩脲法、福林酚法和紫外吸收法，近年来大多数人用考马斯亮蓝法。 选择哪一种方法，一般考虑的原则是准确、操作方便、影响因素少一、光吸收法 蛋白质在280nm左右有吸收高峰，这主要是由于蛋白质中的芳香族氨基酸(Trp和Tyr)的缘故，因此可以用280nrn光吸收值来定量溶液中的蛋白质。但是每种蛋白质中的芳香族氨基酸含量是不同的，而且有较大的差别。最简单的方法是采用280nm光吸收为1时等于lmg/ml来计算。这样简单的处理在准确性上有不足之处，但其测定时间短，用量极少，而且不消耗样品，故被广泛采用。 最准确的
11、方法是用蛋白质的摩尔消光系数计算。在蛋白质纯化后，将此纯的蛋白质对水充分透析，然后冻于或在真空干燥器中干燥，继而在105下恒重，精确称量110mg，再定量溶于一定体积中(通常为1mg/ml)，测量280nm下的光吸收，从而得出该蛋白质的摩尔消光系数。这种方法最为方便、准确，适于微量测定。二、考马斯亮蓝G250法 此法适合于定量10100g，操作简单，应用广泛。考马斯亮蓝G-250又叫“homemade”试剂，每个实验室可以方便地自行配制。三、双缩脲法 此法是基于蛋白质之肽键一CD-NH-有双缩脲反应，在碱性溶液中与Cu2络合显蓝色。该法受蛋白质之特异性影响较小，适用于较大量蛋白质(毫克级)的测
12、定。四、福林一酚法 此法灵敏度和准确性都较高，但操作较繁琐，此外，影响因素(譬如去垢剂干扰这一方法)也较多。Smith提出一种新的BCA测定蛋白质的方法，灵敏度和重复性均佳，受干扰少，Pierce公司有商品供应。第四节 蛋白质的脱盐(除去盐和非共价结合的小分子) 用凝胶过滤法(SephadexG-25或类似的介质)和HPLC的凝胶柱脱盐。应用这类技术时首先要考虑蛋白质的回收，特别对少量蛋白质，尤其是碱性蛋白质，则常常因载体对蛋白质的吸附作用而导致回收差。此时的流动相一般不能用水，而推荐用0.1mol/L醋酸或0.1mol/L碳酸氢铵，因为可以在冻干过程中除去这些挥发性的盐。 在蛋白质纯化的最后
13、阶段，常用挥发性溶剂(例0.1TFA/ACN)的反相HPLC，则可得到无盐的蛋白质样品。 如果对某些蛋白质的回收低，建议用短柱(例PE-ABD公司的RP-300柱，30mmX2.1mm)较为理想。 比HPLC更简单的方法是用C-18的Sek-Pak，或用Millipore公司的超滤离心过滤管，但耗费较大。 如果蛋白质是用SDS-PAGE纯化的，则非共价结合的分子往往可以有效地除去，但又引入了SDS和其他一些分子(Tris，Glycine等)。从SDS-PAGE电泳的凝胶中回收蛋白质的方法很多，但不尽如人意。 如采用电印迹，往往很有效。因为PVDF膜结合蛋白质的亲和力大大高于盐、去垢剂等小分子物
14、质，从而达到蛋白质脱盐的目的。 Stone推荐用三氯醋酸(TCA)沉淀蛋白质而脱盐，蛋白质浓度100g/ml(如果蛋白质浓度太低，得不到沉淀，这时可用真空离心浓缩蛋白质的方法)，加总体积19的100TCA，TCA最后浓度为10，在冰浴放置30rain后离心收集沉淀物，用100l冷丙酮洗两次，气流干燥。 第五节 蛋白质的分子质量测定 近年来由于解决了分离介质的刚性问题，有了HPLC的凝胶过滤系统(例如Waters的1-60、1-125、1-250和Beckman或ToyoSoda的TSK2000SW，3000SW， 4000SW)，这样测定分子质量只需1h即可。 但在一般实验室应用的常规方法是S
15、DS-PAGEL，刊，原理是在SDS存在条件下，蛋白 质表面都携带了大量负电荷，呈杆状分子，在此情况下，不是根据蛋白质的电荷而是根据其分子形状和大小来进行分离。用量为0.1lg，这种方法误差为5一10，但极为简便。 凝胶过滤是测定完整蛋白质分子的分子质量，而SDS-PAGE是测定蛋白质亚基的分子质量，同时用这两种方法测定同一蛋白质分子质量，可以方便地判断样品蛋白质是否寡聚蛋白质。 较新方法是用毛细管电泳(凝胶筛分或无胶筛分)测定蛋白质的分子质量，仅需纳克量，而且还可用积分仪或电脑联机精确定量。同时此法对蛋白质的分辨率和准确性优于SDS-PAGE方法。在某一批IL-3产品的分子质量测定中，用SD
16、S-PAGE得到均一的区带，但在毛细管筛分电泳中为两个毗邻的峰。两个峰的分子质量也有约1 000Da的差异，教材作者进一步用质谱验证了这一结果。 最新的方法是用质谱测定蛋白质的分子质量。20世纪80年代初期，质谱用于测定分子质量的有快原子轰击质谱和等离子体解吸飞行时间质谱。近年来，高分辨率的磁质谱可精确测定分子质量2 000Da以下的多肽。到90年代，由于电喷雾质谱(ESl)有了长足的发展，可以用于测定分子质量约5万Da的蛋白质，而且只需皮摩尔(pmol)量的蛋白质，且其精度可达0.01。而MALDI-TOF则可测定蛋白质分子质量高达二三十万道尔顿。图1.1所示为ESI质谱测定细胞色素c的分子质量， 右角是其电荷分布图，据此计算出分子质量。 第七节 氨基酸定量分析 氨基酸分析在肽谱和点突变肽的分析中是很重要的，同时也可以是很精确的。因为这种肽通常是含520个氨基酸残基的肽，又常常是以特定的某一个酸性或碱性氨基酸为C端。从氨基酸定量分析而言，分析2030个氨基酸残基肽的精确性要比含100200个氨基酸残基的蛋白质的精确性大得多。其次，酶解肽段(最常用胰蛋白酶)可用一个碱性氨基酸作基准1来
