实验实验(shíyàn)(shíyàn)九九 酪氨酸酶的酪氨酸酶的动力学动力学 第一页，共11页 1. 学会学会(xuéhuì)测定酶反应速度的基本方法测定酶反应速度的基本方法2.掌握测定米氏常数掌握测定米氏常数Km值的原理和方法值的原理和方法 【【目目的的(mùdì)和和要要求求】】第二页，共11页 【实验【实验(shíyàn)(shíyàn)原理】原理】 酪氨酸酶催化酪氨酸酶催化(cuī huà)的反应为：的反应为： 475nm第三页，共11页 常用单位时间内、产物的浓度常用单位时间内、产物的浓度(nóngdù)(nóngdù)增加量增加量表示一一、、酶酶活活力力测测定定(cèdìng)— (cèdìng)— 酶酶反反应应初初速速度度的的测测定定(cèdìng):(cèdìng):TimeProduct Concentration v= dC /dtA =εC d : 3600 M-1cm-1d: 1cm确定确定(quèdìng)酶酶反应时间！反应时间！第四页，共11页 二、二、 底物底物(dǐ wù)浓度浓度[S]对酶反应速度：对酶反应速度：一级反应一级反应混合级反应混合级反应零级反应零级反应Effect of substrate concentration on the initial velocity of an enzyme-catalyzed reaction.½ VmaxKm第五页，共11页。
v Km值测定值测定(cèdìng): 双倒数作图双倒数作图法法 第六页，共11页 （（一一））酶酶反反应应初初速速度度的的测测定定(cèdìng)：：---酶酶反反应应时时间间的确定的确定 在比色杯中，按下表依次在比色杯中，按下表依次(yīcì)加入试加入试剂：剂：【实验【实验(shíyàn)(shíyàn)方法】方法】 加入酶液后立即混匀，并每隔加入酶液后立即混匀，并每隔15秒读取秒读取475nm处的吸光值处的吸光值L-多巴（多巴（mL））1磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（mL））1.97酪氨酸酶（酪氨酸酶（mL））0.03注：酪氨酸酶注：酪氨酸酶 5U/ l第七页，共11页 绘制产物浓度绘制产物浓度C-Time 反应曲线，观察酶反应初速度，确定反应曲线，观察酶反应初速度，确定(quèdìng)酶反应时间一般在酶反应时间一般在30~120秒左右 时刻（秒）时刻（秒）A时刻（秒）时刻（秒）A0135151503016545180601957521090225105240120255各时刻各时刻(shíkè)的吸光值记录在的吸光值记录在下表：下表：第八页，共11页 （（二二））米米式式常常数数(chángshù)的测定：的测定：在比色杯中在比色杯中(bēi zhōnɡ)，采用已确定的酶反应时间，采用已确定的酶反应时间X，，分别记录各管反应开始时分别记录各管反应开始时A0和和X秒钟后的秒钟后的A1。
管号管号15mM L－多巴－多巴 (ml)磷酸缓冲液磷酸缓冲液（（ml）） 酪氨酸酶酪氨酸酶（（ml）） 10.22.770.0320.32.670.0330.42.570.0340.52.470.0350.62.370.03每管反应每管反应(fǎnyìng)(fǎnyìng)体系仍为体系仍为3ml3ml第九页，共11页 记录记录(jìlù)数据于下表：数据于下表： 利用双倒数利用双倒数(dǎo shù)(dǎo shù)作图法，横坐标为作图法，横坐标为1/S1/S，纵坐标为，纵坐标为1/v1/v，分，分别求出别求出VmaxVmax和和KmKm 管号管号 L－多巴浓度－多巴浓度（（mM））A0A1ΔA（（A1- A0））V（（mM/min））12345第十页，共11页 【思考题】【思考题】1. 为什么酶活力测定的是酶反应为什么酶活力测定的是酶反应(fǎnyìng)初速度？如初速度？如何确定酶反应何确定酶反应(fǎnyìng)时间？时间？ 2. Km值的意义是什么？值的意义是什么？第十一页，共11页。