试验设计方案叶绿素的提取及叶绿素铜钠的合成指导教师：张英前言叶绿素 ( chlorophyll)属卟啉类化合物 ,和胡萝卜素、叶黄素等同时存在于绿色植物的叶子或微生物体内 ,在植物和微生物的光合反响中起重要作用 叶绿体中含有绿色素〔包括叶绿素a 和叶绿素 b〕和黄色素〔包括胡萝卜素和叶黄素〕两大类它们与类囊体膜蛋白相结合成为色素蛋白复合体它们的化学构造不同，所以它们的物化性质和在光合作用中的地位和作用也不一样这两类色素是酯类化合物，都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙醇等有机溶剂提取 叶绿素 a 和叶绿素 b 的分子中的镁离子易被铜、铁、钴等离子取代而成为叶绿素衍生物 ，可以利用来制取叶绿素铜钠叶绿素分子中的镁可被铜置换出来，将叶绿素经皂化除去环外的酯基，并将中心离子镁用铜取代制成叶绿素铜钠，稳定性显著提高叶绿素铜钠具有色泽亮丽、性能稳定、使用安全等特点，且具有肯定养分价值和保健功能，是一种比叶绿素更为抱负的自然色素，可广泛用于果酒、汽水、食品等生产行业已有争论报导利用浮萍、菠菜、苜蓿等为原料制备叶绿素及其衍生物,但这些原料中叶绿素含量较低 ,制备本钱高国内蚕沙资源丰富 ,叶绿素含量高(0.8%--1.0%) ,作为制备叶绿素及其衍生物的原料 ,已投入工业化生产。
一.试验目的1. 学会从蚕沙中提取叶绿素,并计算提取率2. 初步争论用叶绿素合成叶绿素铜钠的工艺条件3. 分析蚕沙叶绿素铜钠产品的纯度，计算产率4. 通过试验提高综合力量及练习稳固各种相关操作二.试验原理：蚕沙又称蚕屎，是我国丰富的农副的资源，其主要成分有：粗蛋白 13.47%—14.45%，粗脂肪 2.18%-2.29%，粗纤维：15.79%-16.24%，可溶物：56.92%-57.44%〔其中果胶占 12%〕，灰份：9.58%-9.95%叶绿素：1%，有少量粪胡萝卜素，叶黄素和三十烷醇等叶绿素是植物吸取太阳能进展光合作用的主要色素，高等植物中含有叶绿素a 和叶绿素 b 分子式如下：2 叶绿素是一种含有卟吩环的自然色素，它与蛋白质结合存在于植物的绿叶 和绿色的茎中，是植物进展光合作用所必需的催化剂是一个双羧酸的酯，不溶于水，易溶于乙醚，苯，丙酮，乙醇的脂性溶剂，难溶于石油醚所得的叶绿素由于遇热，光，酸，碱等易分解，故将其制成稳定性高的叶绿素铜钠叶绿素铜钠是联合国粮农组织、世界卫生组织〔FAO/WHO〕和我国食品添加剂标准委员会批准使用的一种自然食用色素，叶绿素铜钠以，其固有的鲜亮绿色性， 较叶绿素对光、热有较好的稳定性及其特有的杀菌除臭性能而被广泛用于食品、医药卫生和日用化学工业，同时又是一种价值很高，在我国，生产叶绿素铜钠始终以蚕砂为原料。
叶绿素铜钠为墨绿色，有金属光泽的粉末，无臭或带氨臭，易溶于水，水溶液呈绿色，透亮，无沉淀1%的水溶液的 Ph 值为 9.5-10.2微溶于乙醇和氯仿， 几乎不溶于油脂和石油醚水溶液中参加钙盐会析出沉淀其耐光性比叶绿素强， 加热到 110℃以上会分解叶绿素铜纳盐在 70℃以下稳定性较好；光照对叶绿素铜钠盐稳定性的影响较大；复原剂〔Na2S2O3〕对叶绿素铜钠盐稳定性的影响较大，氧化剂在短时间内对其稳定性的影响不大，但放置的时间不宜超过 30min； 叶绿素铜钠盐在 pH 值为 6 以上的溶液中较为稳定，且有机酸及单糖对其稳定性无明显影响叶绿素可与碱发生皂化反响：Ｃ Ｈ Ｏ Ｎ Ｍｇ + 2ＮａＯＨ = Ｃ ＨＯ Ｎ ＭｇＮａ+ＣＨ ＯＨ + Ｃ Ｈ55 72 5 4ＯＨ34 30 5 4 2 320 39Ｃ Ｈ Ｏ Ｎ Ｍｇ + 2ＮａＯＨ = Ｃ Ｈ Ｏ Ｎ ＭｇＮａ + ＣＨ ＯＨ + Ｃ Ｈ55 70 6 4 34 28 6 4 2 3 20ＯＨ39在酸性条件下，叶绿素钠盐分子中的镁极易被氢原子取代生成褐色的叶绿酸：Ｃ Ｈ Ｏ Ｎ ＭｇＮａ + 4Ｈ+ = Ｃ Ｈ Ｏ Ｎ+ Ｍｇ2+ + 2Ｎａ+34 30 5 4 2 34 34 5 4Ｃ Ｈ Ｏ Ｎ ＭｇＮａ + 4Ｈ+ = Ｃ Ｈ Ｏ Ｎ+ Ｍｇ2+ + 2Ｎａ+34 28 6 4 2 34 32 6 4叶绿酸可与铜盐在加热条件下生成叶绿素铜酸析出，将叶绿素铜酸溶于丙酮，再与碱反响生成叶绿素铜钠：Ｃ Ｈ Ｏ Ｎ +Ｃｕ2+ = Ｃ Ｈ Ｏ Ｎ Ｃｕ+ 2Ｈ+34 34 5 4 34 32 5 4Ｃ Ｈ Ｏ Ｎ +Ｃｕ2+ = Ｃ Ｈ Ｏ Ｎ Ｃｕ+ 2Ｈ+34 32 6 4 34 30 6 4Ｃ Ｈ Ｏ Ｎ Ｃｕ + 2ＮａＯＨ = Ｃ Ｈ Ｏ Ｎ CｕＮａ + 2Ｈ Ｏ34 32 5 4 34 30 5 4 2 2Ｃ Ｈ Ｏ Ｎ Ｃｕ + 2ＮａＯＨ = Ｃ Ｈ Ｏ Ｎ CｕＮａ + 2Ｈ O34 30 6 4 34 28 6 4 2 2蚕粪叶绿素铜钠盐的光谱特性 蚕粪叶绿素铜钠盐水溶液在 360~700之间有2个吸取峰在波长440处有一最大吸取峰,其吸光度为114;在630处有一较小的吸取峰,其吸光度为017“在波长440的吸取峰为叶绿素铜钠盐特有 ,而在630处的吸取峰为叶绿素特有,叶绿素铜钠盐的含量约是蚕粪中叶绿素含量的2倍，所以试验中均承受440的波长测定叶绿素铜钠盐的稳定性。
以下图是蚕粪叶绿素铜钠盐的光谱特性［5］三、仪器和试剂仪器： 粉碎机 , 带温度计、搅拌器的烧瓶 , 回流冷凝管, 恒温槽 , 烧瓶 , 冷凝管 ,抽滤瓶及漏斗 , 胶管 , 玻璃棒 , 100mL 量筒, 试纸，751 分光光度计, 台式天平、分析天平 ,5 个 10ml 容量瓶 ,1 个 100ml 容量瓶，1 个 250ml 容量瓶， 5ml 吸量管, 吸耳球 1 个，原料名称蚕沙 95%乙醇浓盐酸丙酮石油醚 固体 CuSO440%乙醇磷酸盐缓冲液〔pH=7.5〕NaOH 固体用量50g>700ml 适量适量500-1000mL4.8g适量297.6ml9.6g材料及试剂：四、试验步骤〔一〕叶绿素铜钠的合成1、叶绿素的提取：称取 50 克干蚕砂， 投入 500ml 瓶中， 参加 200ml95% 乙醇， 浸过蚕砂约 3 厘米， 水浴加热回流提取 l 小时左右，使水浴温度不超过 80℃〔防止叶绿素 a 和 b 分解〕,提取后降至 30-40℃，滤出提取液,照此法用 95% 乙醇再提取 3 次台并 4 次提取液，注入蒸发瓶中，在低于 80℃下,蒸馏回收乙醇当绝大局部乙醇被回收后，此时减压蒸去残留的溶剂，趁热倾出瓶中液体，冷却至室温， 得到墨绿色膏状物〔叶绿素粗品，不宜久置〕。
此即为叶绿素粗品2、制取叶绿素铜钠盐将上述叶绿素粗品投入皂化瓶内，无水乙醇溶解，参加 5% 的氢氧化钠乙醇溶液，调Ph=11并登记所耗的NaOH的量〔称4.8g NaOH固体溶于120ml95% 乙醇中〕，在60℃下搅拌皂化60min，冷却后参加等量的石油醚，充分搅拌，静置分层，分出下层皂化液．3、叶绿素中镁的铜代用上述步骤中的等量的石油醚再将所得的下层皂化液充分洗涤一次，将洗涤后的皂化浓倒入烧杯中，参加乙醇，保持溶液中乙醇浓度不低于8O％，用浓HCl将溶液pH调到7，参加10ml lO %的硫酸铜〔称4.8g固体CuSO4 溶于48ml乙醇〕， 再用浓HCl调pH至2～3之间，在6O℃下搅拌1小时，趁热过滤，滤渣用95 %乙醇洗涤4次，抽干合并滤液和洗液，参加等量的蒸馏水，有叶绿素铜酸析出，静置4 小时，过滤，依次用蒸馏水、40 %乙醇水溶液及石油醚洗涤3次至石油醚层变为浅绿色，以除去其中的H+及残留的叶黄素和其他有机杂质，抽干4、叶绿素钠的形成固体用丙酮溶解，过滤滤液用5% NaOH乙醇溶液溶解，调pH至11，反响30min,过滤滤渣用无水乙醇洗涤3次，在60℃真空蒸发、枯燥、球磨得蓝绿色带金属光泽品， 略带胺味， 即为叶绿素铜钠盐，称重，计算产率。
〔二〕叶绿素铜钠质量鉴定1.磷酸钠缓冲溶液的配置取 5.8446 克磷酸钠二氢钠溶解在烧杯中，并定容于 250ml 容量瓶中，取 2.0414 克磷酸二氢钾溶解在烧杯中，并定容 100ml 容量瓶中，取 250ml 磷酸钠二氢钠和 47.6ml 磷酸二氢钾混合在一起，即得 PH=7.5 的缓冲溶液2、标准叶绿素铜钠盐的标准曲线称取标准样品 0.01 克〔准确至 0.0002 克〕，加水溶解，移入 10 mL 容量瓶中，加水至刻度，摇匀准确取 5mL 溶液以 pH7.5 磷酸盐缓冲液定容为 100mL， 摇匀，即为 0.005%溶液，用分光光度计测定，在 15 分钟内用 1cm 的比色杯， 在 405nm 波特长测定吸光值〔A〕，以缓冲液作空白比照类似地配制 0.0025%溶液、0.0020%溶液、0.001%溶液、0.0005%溶液，用分光光度计测定，在 15 分钟内用 1cm 的比色杯，在 405nm 波特长测定它们的吸光值〔A〕，以缓冲液作空白比照，并绘制标准曲线3、标准叶绿素铜钠盐的吸取曲线称取标准样品 0.01 克〔准确至 0.0002 克〕，加水溶解，移入 10 mL 容量瓶中，加水至刻度，摇匀。
准确取 1mL 溶液以 pH7.5 磷酸盐缓冲液定容为 100mL， 摇匀，即为 0.001%溶液，此液最大吸取峰为 405nm 与 630nm，吸光比 A405nm/A630nm为 3.2～4.2用分光光度计测定，用 1cm 的比色杯，在 350nm-700nm 波特长测定溶液吸光值 A〔每隔 5nm 或 10nm 测定一次〕，以缓冲液作空白比照，并绘制吸取曲线4、产品叶绿素铜钠盐的吸光比测定称取烘干成品 0.1 克〔准确至 0.0002 克〕，加水溶解，移入 100 mL 容量瓶中，加水至刻度，摇匀沉着量瓶中准确取 2mL 溶液移入 50mL 容量瓶，用 pH7.5 磷酸盐缓冲液定容至刻度，摇匀，即为 0. 004%溶液，此液最大吸取峰为 405nm 与 630nm用分光光度计测定，用 1cm 的比色杯，在 350nm-700nm 波特长测定溶液吸光值 A〔每隔 5nm 或 10nm 测定一次〕，以缓冲液作空白比照，并绘制吸取曲线计算吸光比=五.参考文献AA405nm630nm[1].陈合，许牡丹 主编，型食品原料制备技术与应用，化学工业出版社，2023，12[2].王正平，单旭峰，哈尔滨工程大学化工学院，叶绿素铜钠盐的制备及稳定性争论，化学工程师 2023.7.22[3].王利英 楼炉焕 王慧 钭凌娟 《安徽农业科学》 2023 第 17 期[4].浙江大学 ，华东理工大学，四川大学合编，编大学试验。
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