转 Bt 基因抗虫棉杀虫蛋白表达量的全生长期测定李卓 许崇任 (北京大学生命科学学院环境生物学与生态学系, 北京 100871)摘摘 要要 我们用 ELISA 方法对三种转 Bt 基因抗虫棉，即 33B、GK12、和转双价基因 (Bt 和 CpTI) 的抗虫棉的杀虫蛋白的表达量进行了全生长期的测定，测定的器官包括叶片、花、 蕾和棉铃，其中，花又分为苞叶、花蕊和花瓣测定结果显示杀虫蛋白的表达含量具有一 定的规律性，虫测结果与此基本一致在整个生长期中，杀虫蛋白的表达含量在生长初期 较低，在花期前后达到最大值，此后又渐渐降低在各个器官中的表现均是如此本文还 对不同品种的转基因棉间的杀虫蛋白表达含量进行了比较杀虫蛋白的表达含量的高低直 接关系到杀虫效果，因此，本研究结果对于棉铃虫的综合防治和转 Bt 基因棉花的抗性管理 具有重要的指导意义，同时也对转 Bt 基因棉花的安全性评价提供了一定的依据关键词：关键词：BtBt 棉；棉；BtBt 杀虫蛋白；杀虫蛋白；ELISAELISA；生长期；表达含量；生长期；表达含量棉铃虫是我国棉花生产的重要致灾害虫，常年造成棉花产量损失在 15%-20%之间。
转 Bt 基因棉花是通过遗传工程手段把 Bt 基因导入棉花植株，从而得到对棉铃虫等鳞翅目害 虫具有抗性的棉花目前，已有多种具有抗虫性的 Bt 棉花品系问世并在我国进行了大面 积种植从目前国内外种植的情况来看，Bt 棉对防治棉铃虫的危害，提高棉花产量具有明 显的作用，并且可以减少田间用药量，从而减少对环境的污染但是 Bt 杀虫蛋白在棉花 体内的表达含量并不总是处于很高的水平，在棉花生长期的某些阶段，Bt 杀虫蛋白的表达 含量较低，杀虫作用很弱或不具有杀虫作用，此时，就应进行化学杀虫，这样才能达到综 合防治的目的我们利用本实验室建立的 ELISA 方法，对几种不同品系的 Bt 棉的杀虫蛋白 表达含量进行了全生长期的测定，并与虫测结果相对照，为建立新的棉铃虫的综合防治技 术体系提供了科学依据1 1 材材 料料 与与 方方 法法1 1．．1 1实验材料实验材料青紫蓝兔由北京大学实验动物中心提供HD-1 苏云金杆菌菌种由中科院动物所提供 棉组织由中国农业科学院植保所提供 1 1．．2 2 实验方法实验方法 1 1．．2 2．．1 1 抗原的制备抗原的制备 在 Bt 菌种复苏 48h 后接种，于 30℃培养至芽孢晶体分离，用双相液体分离法提纯晶 体蛋白，所得晶体蛋白的纯度在 95%以上。
冰冻干燥后保存培养基为：鲜鲤鱼 100g，食 糖 100g，琼脂 30g，水 1000mL，pH 值 7. 1 1．．2 2．．2 2 抗体的制备抗体的制备 用制备的晶体蛋白作为抗原，常规免疫年龄在 6 个月、体重在 3kg 左右的雌性健康 青紫蓝兔晶体蛋白溶于 0.015mol/mL NaOH（室温过夜） ，以 10mmol/mL 磷酸钠缓冲液 (pH7.0)透析过夜每次免疫每只兔子抗原量为 1mg，共 3 次，第 1 次加弗氏完全佐剂四足 注射，第 2 次加不完全佐剂背多点注射，第 3 次不加佐剂耳缘静脉注射，每次免疫之间间 隔 30 天半年后颈动脉取血，4℃冰箱静置让血清充分析出双相免疫扩散法测得效价为1:64血清加万分之二的叠氮钠在-20℃保存 1 1．．2 2．．3 3取样取样取样时间从 6 月 19 日到 9 月 7 日，其中，叶片从嫩叶取到老叶，共 5 次，蕾取了 3 次，由于数量上及生长条件的限制，花取了两次，铃取了一次中国农科院植保所负责对 每次取的样品进行虫测 1 1．．2 2．．4 4用用 ELISAELISA 方法进行检测方法进行检测 1． 每个样品称 0.4 克，加 1.0 ml CBS 缓冲液研磨成浆状。
2． 8000 rpm 离心 5 min，取上清液，加可溶性 PVP（聚乙烯吡咯烷酮） 1ml 液加 25 mg PVP.（可以将 PVP 先溶于 CBS 中，使浓度为 50mg/ml，每 ml 样品上清液加 0.5ml）放置 0.5 小时 3． 8000rpm 离心 5min，取上清 50μl，加入酶标板的孔中，加 CBS 液 150μl 补足至 200μl在同一块酶标板上用 2 行（2 个重复）各 8 个孔检测 Bt 蛋白梯度用来作标准曲线 标准蛋白：每孔 10μl Bt 晶体蛋白液+190μl CBS（Bt 蛋白梯度为每孔 0ng、1ng、3ng、5ng、7ng、10ng 、20ng 、40ng， ） ，37℃保温 2.5hr（或 4℃冰箱过夜） 4. 完成步骤 3 之后，立即用 CK 棉籽粉液吸附一抗，一抗同棉籽粉液的体积比是 1:10， 混匀，放 4℃冰箱 2.5 小时以上备用5. 将酶标板孔内液体（包被液）甩去，并在滤纸上轻磕酶标板，使孔中没有残液然后 每孔加 300ul PBST 放置 3min.洗涤，3min 后将液体甩去，再在滤纸上轻磕酶标板，重复三 次 6. 用 PBST 稀释吸附好的一抗，使所给原液稀释 1000 倍。
每孔加一抗稀释液 150μl，37℃保温 0.5hr 7. 用 PBST 洗涤三次，操作同步骤 5，再将二抗（羊抗兔）原液用 PBST 稀释 500 倍每 孔加二抗稀释液 150μl，37℃保温 0.5hr 8. 用 PBST 洗涤 5 次，操作同步骤 5蒸馏水洗涤 2 次，操作同步骤 5 9. 每孔加 100μl 底物显色，20 分钟后每孔加 50μl，2M 硫酸终止反应，用酶标仪在 450nm 测光吸收值 1 1．．2 2．．5 5数据的处理数据的处理首先根据 Bt 蛋白梯度对应的 OD 值（光吸收值）作出回归直线，再根据样品的 OD 值 通过回归直线计算出样品的杀虫蛋白的含量2 2结结 果果 与与 讨讨 论论2 2．．1 1 杀虫蛋白含量在不同器官中的变化杀虫蛋白含量在不同器官中的变化 从以下各图中可以看出，在抗虫棉的整个生长期中，杀虫蛋白的表达含量在不同的器 官中均有一个从低到高，再逐渐降低的趋势，在叶片中，杀虫蛋白的含量在生长季的初期 就有一个较高的表达含量（相对于其他器官） ，在 6 月底，达到最大值，此时是棉株新陈代 谢最旺盛的时期，此后，杀虫蛋白的表达含量逐渐降低，到 9 月初时，含量已经很低；在 棉蕾中，杀虫蛋白的表达含量在 7 月中旬时还很低，最高值出现于 8 月初，此后，逐渐降 低，到 9 月底时，已经没有杀虫蛋白的表达；在花中，杀虫蛋白的表达含量也是如此，从 8 月中旬后逐渐降低，到 9 月底时，几乎已没有杀虫蛋白的表达，由于对花只测定了两次， 尚不能确定其最大值出现在何时，从虫测结果来看，应出现于 8 月初左右；对棉铃，只测 定了一次，在 8 月中旬，其杀虫蛋白的含量很高，甚至比同期的其他器官中的杀虫蛋白含 量还高，虫测结果也显示了这一点。
图 1 杀虫蛋白在叶片中的变化图 2 杀虫蛋白在棉蕾中的变化图 3 杀虫蛋白在苞叶中的变化叶片03006009001200双价 33B GK12双价384.1 257.640.0 33B182.9 1013.0469.1310.821.2 GK12186.0994.1409.5314.112.26月19 日6月29 日7月5日8月20 日9月7日棉蕾0.0100.0200.0300.0双价 33B GK12 双价32.8122.90 33B27.02166.10 GK1230.7297.207月23日8月10日9月7日苞叶0.0100.0200.0300.0 双价 33B GK12双价246.90 33B90.70 GK1293.708月13日9月7日图 4 杀虫蛋白在花瓣中的变化图 5 杀虫蛋白在花蕊中的变化 图 6 杀虫蛋白在棉铃中的变化 花瓣0.0100.0200.0300.0400.0双价 33B GK12双价328.153.9 33B183.969.1 GK12219.967.78月13日9月7日花蕊0.0200.0400.0双价 33B GK12双价82.2033B256.0153.8GK1289.408月13日9月7日铃0.0200.0400.0600.01999年8月18日双价 33B GK12双价510.4 33B371.1 GK12345.88月18日2 2．．2 2 不同器官间杀虫蛋白含量的比较不同器官间杀虫蛋白含量的比较 从以上各图中可以看出，不同器官间的杀虫蛋白表达含量的变化是有不同的，在叶片 中，杀虫蛋白的表达含量最高，也最持久。
最高时，每克叶片含有的杀虫蛋白达 1000ng 左 右，我们注意到，杀虫蛋白的最大值只维持了较短了一段时间，此后，含量大约下降了一 半，约 500ng 左右，但这一水平维持了较长时间，约两个月，这一现象可能是由于棉株进 入旺盛的生长阶段后，体内的氨基酸要作为营养生长的的重要来源，要合成各种所需的蛋 白质，因此使杀虫蛋白含量相对下降，对这一现象，还需做进一步的研究，虫测结果显示， 这一水平已足够起到杀虫作用在其他器官中，从同一时期的测定结果来看，杀虫蛋白含 量的高低顺序依次为，棉铃，花，棉蕾；在花中，花瓣的杀虫蛋白的含量最高，苞叶和花 蕊的含量差不多2 2．．3 3 不同品系抗虫棉间杀虫蛋白含量的比较不同品系抗虫棉间杀虫蛋白含量的比较 从 ELISA 检测的结果来看，三种不同品系的抗虫棉的不同器官在杀虫蛋白的表达含量 上有一些差距，在叶片中，差距最小；在棉蕾中，表达含量的高低依次为 GK12，33B，双 价棉；在苞叶中，33B 和 GK12 相差不多，而双价的含量明显高于前两种；在花瓣中，33B 和 GK12 也相差不多，双价的含量略高于前两种；在花蕊中，GK12 和双价棉相差不多，而 33B 的含量明显明显高于前两种；在棉铃中，33B 和 GK12 相差不多，而双价棉明显高于前 两种；综合以上结果来看，双价棉的杀虫蛋白表达含量要高于 33B 和 GK12，后两种的表达 含量相差不多。
2 2．．4 4 ELISAELISA 检测结果与虫测结果的比较检测结果与虫测结果的比较死亡率器官 采样时间 双价 33B GK12 6 月底 100 100 100 叶片 7 月底 96.7 86.1 76.9 8 月下旬 66.1 68.8 39.1 棉蕾 7 月 93.1 85 88 8 月 100 80 81.6 花 7 月 80 80 68 8 月 88.9 55.6 75 棉铃 8 月 95.8 74 74.3 9 月 96.9 90.9 94 表 1 三种转基因棉各个器官的虫测结果从表 1 可以看出，虫测结果和 ELISA 检测结果基本上是一致的，同样反映了 Bt 杀虫 蛋白在棉株中的表达规律，而且，表明了杀虫蛋白在在不同器官中的的高低差异，与 ELISA 结果不附之处在于，虫测结果表明，棉蕾的杀虫蛋白活性高于花，但由于虫测时使 用的是整花，此前，已有人报道，棉铃虫在花内喜欢取食的器官是花蕊，ELISA 结果表明， 花蕊中。