免疫共沉淀步骤在进展免疫沉淀前，需要取一局部断裂后的染色质做 Input 比照Input 是断裂后的基因组 DNA，需要与沉淀后的样品 DNA 一起经过逆转交联，DNA 纯化，以及最终的PCR 或其他方法检测Input 比照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以依据 Input 中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，依据取样比例换算出 ChIP 的效率，所以 Input 比照是 ChIP 试验必不行少的步骤1.1.1 免疫沉淀1） 蛋白提取（1） 取 10 盘长满 10 cm 大皿的 Hep G2 细胞，弃去培育基，用预冷 PBS 清洗细胞 3 次，吸净 PBS 残液2） 加预冷的裂解液〔含蛋白酶和磷酸酶抑制剂〕至培育皿中〔每皿 500-1000 ul〕，冰上孵育 30 min3） 用细胞刮刮取，收集细胞裂解液并移至离心管，4℃离心 13,000 g，10 min4） 将上清移至离心管中，可用于蛋白浓度测定或远期争论2） 预备磁珠（1） 将 protein A 和 protein G 珠子分别摇摆 5 min 混悬，各吸取 50 ul 珠子到 1.5 ml EP 管中，组成 100 ul 珠子混合物。
2） 小离心机离心 20-30 s，去上清3〕结合抗体很多非生化领域的，宠爱在生理盐或更低盐浓度下进展 coIP，这大大增加了假阳性的几率——很多蛋白间非特异性的黏粘被记录下来这也成为了获得“设定的”相互作用的有效手段b.过表达现在已经存世的相当多的试验论文和数据，其蛋白复合体相互作用的数据是通过过表达，甚至原核 GST pulldown 获得的；笔者认为，在阅读这类文献时，大家要特别留神，多长一个心眼——即始终抱疑心的态度并非说确定不行取，但是有一点很明确，这样的数据送到我们手里，首先我们会要求对方补充内源 性蛋白相互作用的证据，否则该结果一律不采信在《WB 指南》里面我提过，血清中丰富的 BSA 可以被任意抗体识别〔其实也是一种相互作用〕，那么同理高丰度的两种或多种蛋白人为拼凑到一起，为什么不行以非特异性的黏粘或者发生弱的相互作用呢？ 因此，假设想要“特定”的相互作用，可以考虑过表达全部的蛋白，就是核蛋白结合胞浆蛋白甚至膜外表受 体也不稀奇c.不添加 NP40 一类外表活性剂，减弱对非特异性结合的拮抗NP40 除可以在膜上穿孔外，也可以有效的拮抗非特异性的蛋白相互作用，提高 coIP 的特异性。
因此， 削减或不添加 NP40 也可以关心“预期”目的实际上，把握 a、b 两点技巧，根本上可以“无往而不胜”——彻底搞定一切“想要的”相互作用基于以上的缘由，假设想获得切实牢靠的相互作用数据，那么裂解液的选取相当讲究1.首先盐浓度至少 0.15M 或以上盐浓度主要指 Na 盐浓度有人会问为什么不是钾盐？由于钾盐会更简洁跟某些试剂〔或离子〕形成沉淀， 诸如 SDS，因此在某些状况下，钾盐会对后续的某些试验带来未知的麻烦，所以一般盐浓度指 Na 盐盐浓度过低对某些与染色体结合较牢的蛋白的抽提〔非破膜的温存裂解〕效率也较差，可能会丧失局部信息； 而盐浓度过高又会造成某些相互作用较弱的复合体解体，因此，通常选择 0.15——0.3M 做细胞裂解纯化蛋白通常选取 0.6M 以上进展 IP小技巧：最初几遍的漂洗 buff 要和 IP 时的盐浓度一样阅历上，纯化蛋白时，假设用低盐裂解细胞、高盐漂洗去杂质，蛋白丧失较多；所以，一般如前所述固然，也可以高盐裂解低盐漂洗，但是对除杂质不利 2.通常 IP 体系中 NP40 含量 0.2——0.5%NP40 在 0.5——1.0%时，染色体很简洁析出〔很黏，成胶状会裹住 beads，同时粘下很多蛋白〕，用这样的裂解液裂开细胞则可能需要超声。
通常由于习惯上避开增加不必要的操作，所以在非必要的状况下，选择前述的浓度区间3. 可适当添加 EDTA，螯合金属离子保护 DNA 和蛋白特别状况下还可选择添加 EGTA，螯合 Ca2+争论钙相关蛋白此外，裂解液中甘油浓度一般介于 15%-20%之间4. 很多市售或自制的裂解液过于温存，需要考虑承受机械或者超声等手段提高裂解效率〔超声要慎用，可 能破坏弱的相互作用〕但是，有些时候裂解液的冻融又可能影响某些弱的相互作用，所以不太建议冻融裂解液——即最好裂解液制备好后马上进展 coIP固然，假设证明冻融无影响可考虑将蛋白样品保存-80 度待用，这对试验日程的安排会更平易5. 裂解产物的蛋白浓度越高越好前几日回复一贴子，不知道出于什么动因该 LZ 主动稀释裂解样品的蛋白浓度再 IP，所幸不是做 coIP上面提到过表达会制造相互作用的假象，反过来说蛋白浓度过稀，某些相互作用就测不到〔不愿定是弱的相互作用〕因此，细胞的裂解效率会直接影响试验的结果通常细胞 裂解产物的蛋白浓度可达 7-8mg/ml 左右，但是更常规的现象是达不到这种浓度；固然不是说低于7-8mg/ml 就不能进展 coIP，只是需要考虑这一因素。
因此，在多数状况下要尽可能避开稀释你的细胞裂解液补充 1】：切记！试验要先有结果再来挑战极限！在不少人的提问给出的流程中，其开头的样品量往往是以 6 well 或者 60mm dish 为单位的；不否认某些蛋白或复合体确实可以在如此苛刻的条件下完成 coIP但是，更多的时候不是这样子的以我自己研究的复合体为例，其内源性 IP 最低起始细胞数是 40-50% confluence 的 145mm dish；比这个数目更低，试验结果就很不稳定甚至无信号当某些药品、试剂格外昂贵时，鄙人才会勉为其难否则，一律 2 dishes 100% confluence，可以 elute 成 30ul 跑两次；相互作用微弱时，15ul 仅跑一次；再弱，多养几块板〔CE 增加抗体和 beads 仍可保持不变，因此只铺张培育基总比铺张一个冗长的时间走麦城要好〕后续假设为质谱分析，需考虑小规模量产二、IP 前的预备工作：coIP:分为内源性蛋白的相互作用和非内源性蛋白相互作用〔后者包括外源蛋白之间以及外源拖内源蛋 白〕非内源性蛋白的相互作用，主要是通过过表达来实现，通常为简化试验、提高 IP 效率会让外源蛋上标签〔tagged；这也是没有相应的可用于 IP 的内源蛋白抗体之前唯一可行的方案〕，因此就 tag 的使用而言存在很多小技巧。
a.His-tagged 主要用于纯化蛋白有些人宠爱用 His-tagged 蛋白然后进展 coIP，实际上它存在潜在的隐患当时鄙人用 Sigma a-His〔鼠单抗；免费广告〕WB 外源蛋白觉察 CE 里面一塌糊涂〔带型秀丽就是格外多的带〕，那时候还埋怨这个抗体特异性不好后来，当了解到很多蛋白会有富含 histidine 的domain 以后，恍然大悟，恰恰是由于效价格外好，所以很多内源性的蛋白都被该抗体识别同理，假设用 Ni-NTA beads 去 PD His-tagged 的蛋白，完全有可能 PD 那些内源性的富含 histidine domain 的蛋白，造成 coIP 的假象，而这样的蛋白还格外多那么，当时开发 His tag 的主要目的，个人认为主要是可以用廉价的化学试剂洗脱，且 Ni-NTA beads 这类非抗体类的 beads 本钱低廉，可大量工业生产因此，用这个 tag 去生产有活性的蛋白是首选b.tandem-tagged 不能用于分析钙调信号通路tandem tag 实际上从本钱角度和 His tag 差不多，洗脱试剂价格低廉，因此可用于大规模 PD 之后的质谱分析，能猎取最全面的相互作用的信息。
然后由于其中包含钙调蛋白相互作用 domain，自然会结合钙信号相关蛋白，从而干扰或掩盖靶蛋白与钙信号蛋白之间的相互作用，有确定的应用局限固然，笔者不太清楚近年来该方法有无改进，但正是由于引入钙调domain 才实现了降低本钱的目的，因此猜测可能性不大c.Myc、HA、Flag-tagged：Myc 照旧会有自然的干扰，应用略有局限；相较后两者是人工合成特地用于 tagged 蛋白〔有相应的专利，因此目前无论抗体或交联好的 beads 价格都格外昂贵〕，因此干扰最小、最常用如需进一步细致区分，a-Flag 效价比 a-HA 略高，因此更适合 IP固然，公司仍在努力查找效价更好的 a-HA 以及 IP HA 的抗体〔Flag 系 Sigma 专利，因此目前只能忍受其过高的定价〕那么，之前颇流行的 a-HA 鼠源单抗〔其clone 名称为 12CA5〕为何被潜在地摒弃了？缘由或许是：该克隆株可以轻易猎取，流传甚广，因此可以取腹水自制；效价不高，特异性很差尤其是 特异性的问题，用该抗体去交联的 beads 做 coIP，隐患很大〔可以轻易 PD 格外浓的非特异性蛋白〕—— 因此，购置商品化 a-HA beads 时，请认真阅读产品说明〔避开 12CA5 系列〕。
还有 GST 等等，不一一列举了d.tag 的位置将 tag 构建到蛋白的 N 端还是 C 端，也是一个潜在的能够影响 coIP 结果的因素比方， 分泌蛋白的 N 端通常有分泌信号肽，假设将 tag 构建到 N 端，则外泌时会被信号肽酶连同信号肽一起切除；所以这时必需构建在 C 端再如，多数蛋白的 C 端是疏水区，有的时候将 tag 构建在 C 端会影响蛋白原来的空间构造，如恰好 C 端同时是相互作用的构造域，某些时候还可能被遮挡，从而干扰相互作用因此，通常构建质粒的时候是 N 端、C 端 tagged 同时分别构建，以备万一内源性蛋白的相互作用，主要依靠抗体 IP，WB 或者质谱分析另外一条途径，是用外源性蛋白的 coIP 指代内源性蛋白，上文提到的 tandem-tag 技术的目的就是为了实现这种可能它的核心是将外源性蛋白的过表达降低极低水平用于模拟体内环境实际上，在构建外源过表达体系的时候，通常可以得到一系列表达水平差异的稳定单克隆，可以通过进一步筛选获得外源与内源相加与原内源蛋白水平相当的细胞株〔在细胞调控承受的范围以内，内源性蛋白水平会由于相应的外源蛋白表达而适当下调〕，这样的细胞株 可以用于模拟内源性蛋白的相互作用；由于理论上未转变细胞的生理特异，相应的生命过程仍受内源因素 调控。
固然构建相应的细胞株需要转染并筛选，又由于要把握表达量水平，筛选工作耗时更长；并且细胞状态会 由于传代过多而有些转变因此，确定的内源性蛋白的相互作用仍是一个不行或缺的数据，尤其对一个 觉察的蛋白复合体IP 内源性蛋白首先要确认相应的抗体是否能够用于 IP能够用于 IP 的抗体，通常其识别区域恰是自然状态下靶蛋白暴露于外的区段，常为疏水性构造域；因此在自己制备抗体的时候要更多考虑这个因素，至于 商品化的要认真阅读说明在确定抗体可以用于 IP A 蛋白以后，抗体投入量如何把握呢？通常状况下 0.1ug-3ug 较常用〔纯化的抗体〕，其变化取决于抗体的效价，但通常未知状况下0.5ug 或 1ug 是最常用一般假设样品易制备则尽量用样品过饱和抗体，让投入抗体能物尽其用；相反，通常 1ug 抗体已经是过量的另外一个需要考虑的因素是 B 蛋白的大小，尤其B 蛋白当B 蛋白分子量接近 55KDa 或 24KDa 四周的时候，问题会比较简洁由于在最终一步洗脱的过程。