鸭梨 靶向性NO供体型齐墩果酸衍生物的设计、合成和抗肝癌活性 目 录中文摘要 ………………………………………………………………1英文摘要 ………………………………………………………………3第一部分 研究背景 ……………………………………………………7一、一氧化氮(NO)及NO供体型药物1、 NO与肿瘤 2、 NO供体和NO供体型化合物的靶向策略3、 NO供体型抗肿瘤药物4、 NO供体与放疗、化疗或免疫疗法联合用药二、NO供体型抗肝癌药物研究的新思路第二部分 目标化合物的设计一、3-位呋咱氮氧化物修饰的齐墩果酸（OA）衍生物二、3-位O2-糖基偶氮鎓二醇盐修饰的OA衍生物三、3-位O2-乙烯基偶氮鎓二醇盐修饰的OA衍生物第三部分 化学合成和讨论一、3-位呋咱氮氧化物修饰的OA衍生物的合成与讨论二、3-位O2-糖基偶氮鎓二醇盐修饰的OA衍生物的合成与讨论三、3-位O2-乙烯基偶氮鎓二醇盐修饰的OA衍生物合成与讨论四、偶氮鎓二醇盐新的合成方法的探索及其讨论五、纳米TiO2催化NO和芳香伯胺的反应及其讨论第四部分 生物活性研究一、3-位呋咱氮氧化物修饰的OA衍生物的生物活性研究1、体外肿瘤细胞毒性试验2、活性化合物体内药效学研究3、活性化合物作用机理研究4、活性化合物的急性毒性研究5、关于药理结果的讨论二、3-位O2-糖基偶氮鎓二醇盐修饰的OA衍生物生物活性研究1. 体外肿瘤细胞毒性试验2. 活性化合物对正常肝细胞毒性试验3. 活性化合物NO释放试验三、3-位O2-乙烯基偶氮鎓二醇盐修饰的OA衍生物生物活性研究第五部分 构(量)效关系探讨 ……………………………………..第六部分：小结 ……………………………………………………第七部分 化学实验部分 ……………………………………………致谢 ……………………………………………………………………参考文献 ………………………………………………………………… 靶向性NO供体型齐墩果酸衍生物设计、合成和抗肝癌活性博士生： 导 师： 中文摘要一氧化氮（NO）具有“双刃剑” 的作用特点。
大量的研究表明，持续低浓度的NO可以促进细胞的生长，而高浓度的NO则诱导细胞凋亡因此，调控外源性的NO供体靶向肿瘤细胞并释放高浓度的NO成为NO供体型抗肿瘤药物研究的关键本论文内容主要分为两部分，一是研究靶向性NO供体型齐墩果酸衍生物的设计、合成和抗肝癌活性，二是研究具有靶向作用的NO供体——偶氮鎓二醇盐(NONOates)新的合成方法一、靶向性NO供体型齐墩果酸衍生物的设计、合成和抗肝癌活性1、3-位呋咱氮氧化物修饰的齐墩果酸衍生物基于肝癌细胞和正常肝细胞对肝毒物（包括药物）的代谢不同，考虑到肝病治疗药物齐墩果酸(OA)给药后主要在肝脏分布、代谢且具有抗肿瘤作用，同时考虑到NO在调节细胞凋亡时的双重作用, 还考虑到一些肿瘤细胞比正常细胞对NO诱导的细胞凋亡更为敏感等特点，曾选择OA作为先导化合物，在其3位羟基连接呋咱氮氧化物NO供体，设计、合成了一系列化合物，研究目标物对肝的保护作用以及可能的抗肿瘤作用发现其中化合物ZCVI4对肝癌细胞HepG2和Hep3B显示了明显的细胞毒性有趣的是ZCVI4并未诱导其它癌细胞如人前列腺癌细胞、人乳腺癌细胞、人宫颈上皮癌细胞的凋亡，对正常人肝细胞、人肾上皮细胞及小鼠淋巴细胞也无毒性作用，此结果提示，ZCVI4对肝肿瘤细胞具有特异性毒性作用。
由于ZCVI4是一种水和乙醇中极难溶解的化合物，药理试验时须将其溶于DMSO再加适量缓冲剂PBS方能进行操作曾试图通过各种物理方法，制备其微乳、纳米脂质体等口服或注射剂以符合将来临床用药的要求，均未能奏效为了提高其水溶性和生物利用度，保持或者进一步增强其肝肿瘤细胞选择性，我们将ZCVI4分子结构中的羧基与葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸等以酯键相连，制备了糖基衍生物（14-26）研究发现，半乳糖衍生物ZCVI4-2 (15)在水中溶解度较ZCVI4有所改善，且显示了较强的体外抗肝肿瘤作用，对正常肝肿瘤细胞毒性较小；对人肝癌SMMC-7721裸小鼠静脉给药(25 mg/kg), 相对肿瘤增殖率(T/C)分别为44.1%，而对照组5-氟尿嘧啶（5-FU）相同剂量给药, T/C为55.2%，提示ZCVI4-2体内抗肝癌活性可能优于5-FU；急性毒性试验结果表明，小鼠静脉注射ZCVI4-2的 LD50为94.1mg/kg，为其有效剂量(12.5 mg/kg)的7.5倍，显示了较高的安全性研究还发现，ZCVI4-2在肝肿瘤细胞HepG2中NO的释放量约是正常肝细胞LO2中的3倍, 提示ZCVI4-2的肝肿瘤选择性可能与NO释放相关; 加入NO清除剂或将ZCVI4-2结构中的NO供体片段去除后, 原有的抗肿瘤作用基本消失，证明了ZCVI4-2的抗肿瘤作用及其选择性与NO释放相关。
进一步研究发现，ZCVI4-2通过 (至少是部分通过) 促细胞凋亡产生抑制肿瘤生长的效应；其作用机制可能是作用于凋亡相关的关键因子Caspase-3、Bcl-2以及Bax，从而激活凋亡通路，产生促凋亡效应化合物ZCVI4-2作为新型的NO供体型抗肿瘤候选药物正在进行深入研究2、3-位O2-糖基偶氮鎓二醇盐修饰的齐墩果酸衍生物偶氮鎓二醇盐(NONOates)是一类重要的NO供体，它在生理条件下不稳定，极易释放NO，半衰期从几分钟到几小时不等但是一旦将结构中的O2 原子修饰后，就能形成稳定的前药，它在体内某些特定酶作用下，有可能靶向性地在肿瘤细胞释放NO, 发挥抗肿瘤作用为了进一步增强目标化合物的靶向性并改善其水溶性，我们将ZCVI4-2结构中的的呋咱氮氧化物片段替换成偶氮鎓二醇盐片段，并在OA的28位羧基上连接糖基以增加水溶性在考虑偶氮鎓二醇盐的O2保护基时，我们选择了糖基保护，这是因为糖基化的偶氮鎓二醇盐在肿瘤细胞表面过度表达的单糖转运子的作用下，能特异性地转运至肿瘤细胞内，然后在β糖苷酶的作用下释放NO；半乳糖等修饰后的产物有可能通过与肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体等作用，从而定向地转运到肝脏；另一方面，糖基对于水溶性贡献比较大，有利于后期的制剂研究。
共设计合成19个目标化合物（27-44），体外抗肿瘤活性筛选表明，化合物27-29表现出较强的肝肿瘤细胞毒性作用，IC50值与ZCVI4-2相当，且对正常的肝细胞毒性较小深入的药理研究正在进行中3、3-位O2-乙烯基偶氮鎓二醇盐修饰的齐墩果酸衍生物已知乙烯基保护的偶氮鎓二醇盐盐能特异性地被肝脏P450酶活化，并释放出NO研究表明，OA是正常肝细胞P450某些亚型的竞争性抑制剂，而对肝肿瘤细胞表达的P50亚型没有影响，提示肝癌细胞和正常肝细胞对OA或其衍生物的代谢可能不同因此我们在OA的3-位连接O2-乙烯基保护的偶氮鎓二醇钠盐，同时考虑整个分子的水溶性，在OA的28-位连接糖基，共合成目标化合物28个（45-72）设想它们可能在正常肝细胞释放少量NO，起到肝细保护作用, 而在肝肿瘤细胞释放大量的NO，发挥细胞毒性作用体外肝肿瘤细胞毒性筛选试验表明，化合物51较ZCVI4-2具有更强的抗肝肿瘤活性，进一步的药理研究正在进行中二、靶向作用的NO供体——偶氮鎓二醇盐新的合成方法在上述基于偶氮鎓二醇盐的OA衍生物设计、合成中，我们还面临一个关健问题: 如何方便、快捷地获得结构类型多样的偶氮鎓二醇盐？已知文献制备条件相当苛刻，需要特殊的设备以及在低温、和/或高压下反应等。
因而，发展新的方法来高效制备偶氮鎓二醇盐非常迫切且意义重大考虑到纳米TiO2对气体小分子有一定的吸附和活化作用，我们首次将纳米TiO2引入到偶氮鎓二醇钠盐的制备过程中发现将NO气体和脂肪仲胺经TiO2催化反应，在常温常压下可制备结构多样化的偶氮鎓二醇钠盐，且产率与文献报道相比有较大提高当我们把此法推广到NO气体和芳香伯胺的反应时，却意外得到了另外一类重要的NO供体cupferrons，而不是相应的偶氮鎓二醇钠盐我们因此发展了一种全新的偶氮鎓二醇盐和cupferrons制备方法，并提出了反应的可能机理我们的研究不仅扩展了NO所参与的反应范畴，更为重要的是，还推动了靶向性NO供体型药物的研究这一新方法的进一步应用还在探索中，我们将陆续报道其研究结果关键词：靶向性；一氧化氮供体；偶氮鎓二醇盐；齐墩果酸；抗肝癌药物Studies on design, synthesis and anti-hepatocellular carcinoma activity of site-targeting and NO-donating oleanolic acid derivatives(Dissertation for Ph D degree)Candidate: Chen LiSupervisor: Prof. Yihua Zhang（未修改）AbstractThis dissertation is mainly divided into two parts: one is “Design, synthesis and anti-hepatocellular carcinoma activity of site-targeting and nitric oxide-donating oleanolic acid derivatives”, and the other is “A novel approach for the preparation of NO donor NONOates”.1、Design, synthesis and anti-hepatocellular carcinoma activity of site-targeting and nitric oxide-donating oleanolic acid derivatives Nitric oxide (NO) endogenously produced from L-arginine is involved in numerous physiological and pathological processes. It is known that high concentrations of NO may be cytostatic or cytotoxic to tumor cells leading to apoptosis, whereas relatively low levels of NO can have opposite effect and promote tumor growth and proliferation. Since NO is a janus-faced molecule, the selective delivery of exogenous NO to the specific tissues has recently been attracting much attention, particularly in the field of anticancer therapy. However, to the best of our knowledge there are few NO donor drugs with anti-hepatocellular carcinoma (HCC) 。