氨基酸的紫外-可见光谱分析Ultraviolet-Visible Spectroscopy Analysis of Amino Acids姓名：吉武良 院系：化院20系 学号：PB13206270摘要：紫外-可见吸收光谱是基于分子电子跃迁产生吸收光谱进行分析测定的仪器分析方法，广泛应用于具有生色团或共轭结构有机物的定性和定量分析，也可以鉴定电荷转移和配位体场无机化合物本实验以三种芳香氨基酸，即苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸的分析为例，学习紫外-可见光谱分析的原理，操作以及定性和定量分析方法关键词：紫外-可见吸收光谱 氨基酸 苯丙氨酸 酪氨酸 色氨酸 定性 定量Abstract：Ultraviolet-visible spectroscopy analysis is an absorption spectroscopy based on molecular electronic transitions.It is used to qualitatively and quantitatively analyze conjugated organics,as well as inorganic compounds with electronic transitions or transition metal ions. This experiment is designed in the example of UV-Vis analysis of aromatic amino acids,that is Phenylalanine,Tyrosine and Tryptophan, to learn principle of UV-vis analysis,operation of UV-Vis spectrometer and approach to qualitatively and quantitatively analyze.Key words：Ultraviolet-visible spectroscopy analysis,Phenylalanine,Tyrosine Tryptophan,Amino acid, Qualitative,Quantitative.一、前言紫外-可见分光光度法属于吸收光谱法，分子中的电子总是处在某一种运动状态中，每一种状态都具有一定的能量，属于一定的能级。
电子由于受到光、热、电等的激发，从一个能级转移到另一个能级，称为跃迁当这些电子吸收了外来辐射的能量，就从一个能量较低的能级跃迁到另一个能量较高的能级如图1为电子跃迁示意图）物质对不同波长的光线具有不同的吸收能力，如果改变通过某一吸收物质的入射光的波长，并纪录该物质在每一波长处的吸光度（A）,然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，这样得到的谱图为该物质的吸收光谱或吸收曲线当一定波长的光通过某物质的溶液时，入射光强度I0与透过光强度It之比的对数与该物质的浓度c及厚度b成正比其数学表达式为：式为Lambert-Beer定律，是分光光度法定量分析的基础，其中T为透光率(透射比）Figure 1:电子跃迁示意图物质的吸收光谱反映了它在不同的光谱区域内吸收能力的分布情况，不同的物质，由于分子结构不同，吸收光谱也不同，可以从波形、波峰的强度、位置及其数目反映出来，因此，吸收光谱带有分子结构与组成的信息紫外-可见分光光度计是分析的仪器，主要分为单光束和双光束，单波长和双波长光度计以下为单波长双光束分光光度计的工作原理示意图Figure 2：紫外-可见分光光度计原理图氨基酸类物质的一个重要光学性质是对光有吸收作用。
20种氨基酸在可见光区域均无光吸收，在远紫外区（<220 nm）均有光吸收，在紫外区（近紫外区）（220 nm—300 nm）只有三种AA有光吸收能力，这三种氨基酸分别是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸，因为它们的结构均含有含有苯环共轭双键系统苯丙氨酸最大吸收波长在259 nm、酪氨酸在278 nm、色氨酸在279 nm，蛋白质一般都含有这三种氨基酸残基，所以其最大光吸收在大约280 nm波长处，因此能利用分光光度法很方便的测定蛋白质的含量本实验将对苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸三种氨基酸进行光谱测定及相关定量测定三种氨基酸结构如下：Figure3：芳香族氨基酸结构二、实验部分（Ⅰ）试剂标准溶液(a)：1.0 g/L的苯丙氨酸溶液；标准溶液(b)：0.1 g/L的酪氨酸溶液；标准溶液(c)：0.1 g/L的酪氨酸溶液（所有溶液均用去离子水配制）；色氨酸待测样Ⅱ）仪器：UV-VIS-NIR Spectrophotometer(UV-3600,SHIMADZU);0.5mL、1.0mL、2.0mL移液管若干；10mL带塞比色管若干Ⅲ）实验步骤（1）分别移取标准溶液(a)（2.0 g/L，1.0 mL）、标准溶液(b)（0.4 g/L，1 mL）和标准溶液(c)（0.4 g/L，0.4 mL）标准溶液于10 mL比色管中，用去离子水稀释、定容、摇匀，待用。
2）分别移取0.00、0.5、1.0、1.5、2.0 mL标准溶液（b）于5个10 mL比色管中，并用去离子水稀释、定容，摇匀，待用3）双击分光光度计图标“UVProbe”,出现软件界面，点左下角“连接”，系统开始自检，等系统自检结束预热15-30分钟待仪器稳定后方可使用4）在光谱测量模式下，以去离子水为参比溶液，分别绘制步骤（1）中各溶液在200～350nm波长范围内的吸收光谱并记录各标准溶液的λmax 5）在定量测定模式下，以去离子水为参比溶液，测定步骤（2）中的各标准溶液在λmax处的吸光度6）在步骤5同样条件下，测定未知样品溶液在λmax处的吸光度三、分析和讨论1、结果（1） 氨基酸定性分析结果如下图：Figure 4：氨基酸定性分析吸收光谱（2）Figure 5：色氨酸定量分析2、讨论（1） 定性分析：由图4可知：苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸吸收峰波长依次增大，摩尔吸光系数依次增大解释如下：在紫外-可见光区域内能发生跃迁的原子团叫生色团，如各种不饱和键，而且吸收峰波长和摩尔吸光系数随共轭程度增加而增大不能发生跃迁但和生色团相连可以增大吸收峰波长，增强吸收强度的原子团叫助色团，如羟基，氨基，烷氧基，巯基，卤素等。
由此可知：酪氨酸因为有羟基，色氨酸因为有吡咯环存在，吸收峰波长和摩尔吸光系数增大2） 定量分析：对于单组分物质，定量分析可以做出吸光度-浓度曲线求未知样但对于混合物，如果各组分吸收相干扰，就要想办法消除实验中酪氨酸和色氨酸吸收峰接近，干扰严重，不能简单计算常用的方法是导数分光光度法，其原理为：根据Lambert-Beer定律，吸光度是波长函数将吸光度对波长求导，得吸光度各阶导数仍与浓度成正比，所以可以用于定量分析做法为：对待测组分和干扰吸收曲线求各阶导数，找出待测物峰值出现在干扰物为零的阶，利用该阶导数定量分析以下为色氨酸和酪氨酸1至4阶导数图像：Figure 6：酪氨酸和色氨酸吸收曲线各阶导数由上图可知，二阶导数在230nm左右时，酪氨酸吸收为0，色氨酸吸收最大，故可以选择二阶导数对图5求二阶导数，图像如下：Figure 7：定量分析吸收曲线二阶导数由图中数据，做出工作曲线如下图：Figure8：色氨酸工作曲线由拟合报告知：未知样吸光度为0.030，则故未知样浓度四、思考题（1） 本实验是采用紫外吸收光谱中最大吸收波长进行测定的，是否可以在波 长较短的吸收峰下进行定量测定，为什么？答：理论上，吸光度在任意波长处都与浓度呈正比，只要满足待测物不被干扰，可以选择任意波长处测定。
但一般选择吸收峰处，因为此处吸光度大，测量误差小2） 被测物浓度过大或过小对测量有何影响？应如何调整？调整的依据是什么？答：浓度过大会超过工作曲线线性范围，浓度过小测量误差会增大如果范围不合适，要调整待测物浓度，比如稀释或浓缩使其落性范围内或者也可以选择其他合适波长处测量（浓度高时）3） 思考紫外-可见分光光度法应用于蛋白质测量的依据，并设计相应的实验方案，测定奶粉中蛋白质的含量答：双缩脲试剂与蛋白质形成紫色络合物，在540nm处有吸收峰，吸收强度与蛋白质浓度呈正比，而与蛋白质分子量和氨基酸组成无关实验方案：通过样品扫描找出最大吸收峰波长，然后配制奶粉蛋白质标样并作出工作曲线，依据工作曲线和测出的奶粉样本吸光度可以求出奶粉蛋白质含量五、参考文献1.中国科学技术大学化学与材料科学学院实验中学.仪器分析实验.合肥：中国科学技术大学出版社，2011年10月.2.分析化学（第五版，下册）.武汉大学等编.北京，高等教育出版社，2006年1月1日.。