生物化学实验讲义化学工程与技术学院基础部实验一酪蛋白的制备一、目的学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法二、原理．牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L酪蛋白是一些含磷蛋白质的混淆物，等电点为4.7利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就积淀出来用乙醇清洗积淀物，除掉脂类杂质后即可获得纯的酪蛋白三、器械1、离心计2、．抽滤装置3、精细pH试纸或酸度计4、电炉5、烧杯6、温度计．四、试剂与资料1、牛奶2500mL2、95％乙醇1200mL3、无水乙醚1200mL4、0.2mol／LpH4.7醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL5、．乙醇—乙醚混淆液2000mL五、操作1、将100mL牛奶加热至40℃在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液100mL用精细pH试纸或酸度计调pH至4.7将上述悬浮液冷却至室温离心15分钟(3000r／min)弃去清液，得酪蛋白粗制品2、用水洗积淀3次，离心10分钟(3000r／min)，弃去上清液3、在积淀中加入30mL乙醇，搅拌片晌，将所有悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤用乙醇—乙醚混淆液洗积淀2次最后用乙醚洗积淀2次，抽干4、将积淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯晶。
5、正确称重，计算含量和得率含量：酪蛋白g／100mL牛乳(g％)得率：测得含量100%理论含量思虑题1、制备高产率纯酪蛋白的重点是什么？实验二小麦萌生前后淀粉酶活力的比较一、目的1. 学习分光光度计的原理和使用方法2. 学习测定淀粉酶活力的方法3.认识小麦萌生前后淀粉酶活力的变化二、原理种子中储藏的糖类主要以淀粉的形式存在淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖2（C6H10O5）n+nH2OnC12H22O11麦芽糖有复原性，能使3，5---二硝基水杨酸复原成棕色的3-氨基-5-硝基水扬酸后者可用分光光度计测定休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌动后，酶活力渐渐增强，并跟着抽芽天数增添而增添本实验察看小麦种子萌生前后淀粉酶活力的变化三、器械1.25mL刻度试管2.吸管3.离心管4.乳钵5.分光光度计6.恒温水浴7. 离心计四、试剂和资料1、小麦种子2、o.1％标准麦芽糖溶液精准称量100mg麦芽糖，用少许水溶解后，移入100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度3.pH6.9，0.02mol/L磷酸缓冲液0.2mol/L磷酸二氢钾67.5mL与0.2mol/L磷酸氢二钾82.5混淆，稀释10倍4、1％淀粉溶液1g可溶性淀粉溶于100mL0.02mol/L磷酸缓冲液中，此中含有0.0067mol/L氯化钠。
5、1％3，5—二硝基水杨酸试剂将 1.00g3，5—二硝基水扬酸溶于20ml2ML1NaOH溶液和50ml水中，加入30g酒石酸钾钠定容至100ml6、1％氯化钠溶液五、实验操作1、种子抽芽小麦种子浸泡2.5小时后，放入25℃恒温箱内或在、室温下抽芽2、酶液提取取抽芽第3或第4天的幼苗15株，放入乳钵内，加入1%氯化钠溶液10mL，使劲磨碎在室温下搁置20分钟，搅拌几次而后将提取液离心（ 1500r/min）6—7分钟将上清液倒人量筒，测定酶提取液的整体积进行酶活力测准时，用缓冲液将抽芽第3或第4天的幼苗稀释10倍取干燥种子15粒作比较（提取步骤同上）3、酶活力测定（1）取25mL刻度试管4支，编号按下表要求加入各试剂（各试剂须在25℃预热10分钟）试管1234标号干燥种子抽芽第3或第4标准空白试剂的酶提取天的幼苗的酶管管液提取液酶液（mL）0.50.5——标准麦芽——0.5—糖溶液（mL）1％淀粉溶1111液（mL）水（mL）———0.5将各管混匀，放在25℃水浴中，保温3分钟后，立即向各管加入1％3，5—二硝基水杨酸溶液2mL 2）拿出各试管，放入开水浴加热5分钟冷却至室温，加水稀释至25mL。
并混匀在A500nm处测定各管的吸光度填入表中试管号干燥种子抽芽第3或标准管空白管的酶提取第4天的幼液苗的酶提取液A500nm吸光度4、计算依据溶液的浓度与光汲取值成正比的关系，A酶C标准C酶A标准本实验规定：25℃时3min内水解淀粉开释1mg麦芽糖所需的酶量为1个酶活力单位（u）酶活力计算公式为：酶活力C酶V酶n酶式中：C酶酶液麦芽糖的浓度，V酶提取酶液的整体积，n酶酶液稀释倍数思虑题1、为何此酶提纯整个过程在0—5条件下进行？而测酶的活力时要在25预保温？反响后又放入开水浴中？2、实验结果说明什么？实验三纸层析法分别判定氨基酸一、目的经过氨基酸的分别，学习纸层析法的基来源理及操作方法二、原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分派层析法层析溶剂由有机溶剂和水构成物质被分别后在纸层析图谱上的地点是用Rf值(比移)来表示的：Rf原点到层析点中心的距离b原点到溶剂前沿的距离aRf溶剂前沿在必定的条件下某种物质的只层析点值是常数Rf值的大小与物质的构造、ab性原点质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等要素相关本实验利用纸层析法分别氨基酸三、器械1.层析缸2.毛细管3.喷雾器4.培育皿5.层析滤纸(新华一号)四、试剂1、扩展剂650mL4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混淆物。
将20mL正丁醇和5mL冰醋酸放入分液漏斗中，与15mL水混淆，充分振荡，静置后分层，放出基层水层取漏斗内的扩展剂约5mL置于小烧杯中做均衡溶剂，其余的倒人培育皿中备用2、氨基酸溶液0.5％的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混淆液(各组份浓度均为0.5％)各5mL3、显色剂50～100mL0. 1％水合茚三酮正丁醇溶液五、操作1.将盛有均衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中2.取层析滤纸(长22cm、宽14cm)一张在纸的—端距边沿2～3cm处用用铅笔画一条直线，在此直线上每间隔2cm作一记号如图1234563.点样用毛细管将各氨基酸样品分别点在这6 个地点上，干后再点一次每点在纸上扩散的直径最大不超出3mm4.扩展用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不可以接触将盛有约20mL扩展剂的培育皿快速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培育皿中(点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1cm)待溶剂上涨15—20cm时即拿出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界限，自然干燥或用吹风机热风吹干5.显色用喷雾器均匀喷上O.1％茚三酮正丁醇溶液，而后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑点。
6.计算各样氨基酸的只Rf值思虑题1、何谓纸层析法2、何谓片Rf值影响Rf值的主要要素是什么3、如何制备扩展剂3、层析缸中均衡溶剂的作用是什么？实验四酶的特征一、目的加深对酶的性质的认识二、内容本实验由温度对酶活力的影响；pH对酶活力的影响；酶的激活剂及克制剂；酶的专—性4组实验构成一)温度对酶活力的影响1、原理酶的催化作用受温度的影响在最适温度下，酶的反响速度最高大部分动物酶的最适温度为37-40℃，植物酶的最适温度为50～60℃酶对温度的稳固性与其存在形式相关有些酶的干燥制剂，虽加热到100℃，其活性井无显然改变，但在100℃的溶液中却很快地完整失掉活性低温能降低或克制酶的活性，但不可以使酶失活2、器械(1)试管及试管架(2)恒温水浴(3)冰浴(4)开水浴3、试剂和资料(1)0.2％淀粉的0.3％氯化钠溶液150mL需新鲜配制(2)稀释200倍的唾液50mL用蒸馏水漱口，以消除食品残渣，再含一口蒸馏水，半分钟后使其流入量筒并稀释200倍(稀释倍数可依据各人唾液淀粉酶活性调整)，混匀备用3)碘化钾—碘溶液50mL将碘化钾20g及碘l0g溶于100mL水中使用前稀释10倍4、操作淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。
糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色最简单的糊精遇碘不呈颜色，麦芽糖遇碘也不呈色在不一样温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混淆物遇碘体现的颜色来判断取3支试管，编号后按下表加入试剂：管号123淀粉溶液(mL)1.51.51.5稀释唾液(mL)11—煮拂过的稀释唾——1液 (mL)摇匀后，将1、3号两试管放入37℃恒温水浴中，2号试管放人冰水中10分钟后拿出(将2号管内液体分为两半)，用碘化钾—碘溶液来查验1、2、3号管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度记录并解说结果，将2号管剩下的一半溶液放人37℃水浴中持续保温10分钟后，再用碘液实验，结果如何(二)pH对酶活性的影响1、原理酶的恬力受环境p。