Biochemistry Sixth Edition Chapter 17: The Citric Acid Cycle Copyright 2007 by W. H. Freeman and Company Berg Tymoczko Stryer 环形交叉路，或者转盘，使拥挤的交通变得顺畅的中心 柠檬酸循环是细胞的生化中心所在通常细胞燃料被加工 成乙酰辅酶A、进入该循环柠檬酸循环的组分也是生物合成 的前体之一 厌氧条件下，细胞将葡 萄糖糖酵解糖酵解转化成丙酮 酸，一分子葡萄糖只产 生两分子ATP柠檬酸 循环接着将丙酮酸转化 成CO2柠檬酸循环是 燃料分子氧化过程中最 后的共同途径，也称为 三羧酸循环或Krebs循 环柠檬酸循环是糖、 脂肪酸、和氨基酸氧化 过程最后的共同途径 多数燃料分子被加工成 乙酰辅酶A的形式进入 三羧酸循环 图图17.1 线粒体电子显微镜图谱显示线粒体是双膜结构内膜有很 多凹陷形成嵴（cristae）粒体基质进行氧化脱羧和柠檬酸循环 的其它反应 葡萄糖酵解（在细胞质进行）产生的丙酮酸，经氧化脱羧形成 乙酰辅酶A，进入柠檬酸循环（粒体基质）进行（图17.1）。
柠檬酸循环收获高能电子柠檬酸循环收获高能电子 柠檬酸循环是细胞代谢的中心任何分子被转 化成乙酰辅酶A或三羧酸循环的其他组分就可以进 行有氧代谢这个循环也为许多生物分子（如氨基 酸、核苷酸碱基、卜啉）的合成提供原材料柠檬 酸循环的草酰乙酸组分也是葡萄糖合成的原料 在燃料分子转化成ATP过程中三羧酸循环起什 么作用？燃料分子是可以被氧化（即失去电子）的 碳化物柠檬酸循环含有一系列氧化-还原反应， 导致乙酰基被氧化成两个CO2在氧化过程中产生 的高能电子被捕获，用来驱动ATP的合成柠檬酸 循环的功能是获取碳燃料的高能电子 图图17.2显示柠檬酸循环的总况显示柠檬酸循环的总况草酰乙酸与乙酰基缩合形 成六碳原子的三羧酸这个六碳化合物连续丢失两分子 CO2，与此同时两次释放高能电子，形成四碳化合物这 个四碳化合物被进一步加工，生成草酰乙酸，启动另一轮 三羧酸循环乙酰基进入循环后被转化成两分子CO2 柠檬酸循环氧化二碳单位，形成两分子CO2， 1分子GTP，和高能电子（高能电子以NADH和 FADH2的形式存在）注意：柠檬酸循环只是从乙 酰辅酶A移去电子，并用这种电子形成三分子 NADH（三个氢负离子、即六个电子转移给NAD+ 形成3个NADH）、和一分子FADH2（一对氢原子 、即两个电子转移给FAD形成一个FADH2）。
但柠 檬酸循环本身既不产生大量ATP，也不利用氧气作 为反应物质 电子携带分子NADH和FADH2经一系列的膜蛋 白传递将电子传递给氧气，产生跨膜质子梯度质 子跨膜回流，经过ATP合成酶时，所释放的能量将 ADP和磷酸转化成ATP 图图17.3 细胞呼吸细胞呼吸柠檬酸循环构成细胞呼吸的第一阶段，将碳燃 料的电子转移给电子载体形成NADH和FADH2（左边）这些高 能电子转移给氧气分子产生跨膜质子梯度(红色）随后利用质 子梯度合成ATP(绿色）氧气还原和ATP合成构成氧化磷酸化 17.1丙酮酸脱氢酶联结糖酵解和柠檬酸循环丙酮酸脱氢酶联结糖酵解和柠檬酸循环 碳水化合物经过糖酵解过程变成丙酮酸在厌 氧条件下，丙酮酸转化成乳酸或者乙醇（实际情况 取决于生物体自身类型）在有氧条件下，丙酮酸 由线粒体膜上特定的载体蛋白质运输到线粒体内 粒体基质，丙酮酸在丙酮酸脱氢酶的作用下氧 化脱羧生成乙酰辅酶A 这个不可逆反应是糖酵解和柠檬酸循环之间的 连接纽带注意：此反应丙酮酸脱氢酶复合物催化 产生二氧化碳、并将俘获的高能电子以NADH形式 储存因此，因此丙酮酸脱羧酶促反应有柠檬酸循 环反应所具有的很多关键特征。
厌氧条件下，细胞将 葡萄糖糖酵解糖酵解转化成 丙酮酸，接着被加工 成乙酰辅酶A的形式 进入三羧酸循环 大肠杆菌丙酮酸脱氢酶 丙酮酸脱羧酶复合物是由3种活性不同的酶构成的、高度整合 的、巨型复合物丙酮酸脱氢酶复合物属于同源复合物家族的成员 这个家族包括柠檬酸循环酶a-酮戊二酸脱氢酶复合物这些复合 物巨大，分子质量从400万到1000万道尔顿，其复杂的结构能够将 待转移基团（活性基团用绳状结构与酶复合物结构的核心连接）从 一个活性位点转移到另一活性位点 图17.5 大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合物的电子显微图谱 机理：从丙酮酸合成乙酰辅酶机理：从丙酮酸合成乙酰辅酶A需要三种酶和五种辅酶需要三种酶和五种辅酶 丙酮酸脱氢酶促反应机理很复杂，需要丙酮酸脱氢酶 复合体的三种酶活性和五种辅酶的参与辅酶硫胺焦磷酸 （thiamine pyrophosphate，TPP）、硫辛酸（lipoic acid)、 和FAD是酶的辅助因子，CoA和NAD+是定量反应的协助 因子 丙酮酸转化成乙酰辅酶A有三步：脱羧、氧化、和 乙酰基转移给辅酶A这些反应必需偶联才能保存 脱羧反应所释放的自由能，驱动后续的NADH和乙 酰CoA的形成反应。
脱羧反应脱羧反应：丙酮酸结合TPP，接着脱羧生 成羟乙基-TPP 此反应由多酶复合体的丙酮酸脱氢酶组分（E1）催化TPP是丙酮 酸脱氢酶组分的辅基 氧化反应氧化反应：连接于TPP上的羟乙基氧化形成乙酰基 ，同时将乙酰基转移给硫辛酰胺（硫辛酸与赖氨酸 侧链氨基连接形成的衍生物）此反应形成了富含 能量的硫脂 催化剂也是丙酮酸脱氢酶组分 E1，产物是乙酰硫辛酰胺 图17.6 E1脱羧反应的机制E1是丙酮酸脱氢酶复合物的 丙酮酸脱氢酶组分辅基TPP的一个关键特征是噻唑环N 和S原子之间的碳原子比大多数=CH基团的酸性大得多 ，其pKa值接近101) 这个碳原子解离形成碳负离子； (2)碳负离子加成到丙酮酸的羰基；(3)丙酮酸脱羧TPP 带正电的环作为电子槽能够稳定负电荷，负电荷转移到 环上，完成脱羧4）质子化作用产生羟乙基-TPP 乙酰CoA的形成：乙酰基从乙酰硫锌酰胺转移给 CoA，形成乙酰CoA复合体的二氢硫辛酸转乙 酰酶(E2)催化这一反应高能硫酯键在乙酰基转 移到CoA的过程中被保留辅酶A是很多酰基的 载体，其中乙酰基是最简单的此时将丙酮酸转 化成乙酰辅酶A，后者是柠檬酸循环的燃料。
第四步，丙酮酸脱氢酶的二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3) 组分催化，将二氢硫辛酰胺重新氧化成硫锌酰胺( 氧化型)在此过程中，高能电子先传递给这个酶 的辅基FAD，然后传递给NAD+才能启动下一轮 催化反应 电子从FADH2转移给NAD+是非常特别的(因为通常是将NADH 转移给FAD)因FADH2与转酶蛋白结合，增加了FADH2转移势能 ，使之有能力将电子转移给NAD+与FAD或FMN紧密结合的蛋白 质称为黄素蛋白黄素蛋白 灵活的接头使硫锌酰胺能够在复合物各个活性位点间移动灵活的接头使硫锌酰胺能够在复合物各个活性位点间移动 丙酮酸脱氢酶复合物的各组分酶的结构已经清楚，但是这些组分的 结构来自不同的物种和不同复合物现在我们能够重构这个复合物 的原子结构模型以了解其活性（图17.7） 图17.7 丙酮酸脱氢酶复 合物的示意图转乙酰 基酶（E2)核心用红色表 示，丙酮酸脱氢酶组分 E1用黄色表示，二氢硫 辛酰胺脱氢酶(E3)用绿色 表示 转乙酰酶组分E2形 成这个复合物的核 心，有8个催化三聚 体组装成一个空心 立方体每个三聚 体有三个主要结构 域N-端结构域小 ，有一个柔软的硫 辛酰胺与这个区域 的赖氨酸侧链氨基 结合。
该区域与生 物素结合域同源 硫辛酰胺结构域后 面有一个小结构域 与复合物的E3组分 结合后面的大结 构域是转乙酰基酶 结构域 E1是一个a2b2四聚体，E3是ab二聚体，24拷贝的E1 和12拷贝的E3围绕E2核三个不同位点如何联合工作（ 图17.9）？关键是E2亚基有一个长的柔软的硫辛酰胺携 带底物从一个活性位点摆渡到另一个活性位点 1. E1的活性催化丙酮酸脱羧、形成羟乙基TPP中间体和 CO2（离开复合体的第一个产物）活性中心位于E1复 合物深部，用20A长度的疏水管道与蛋白表面联系 2. E2将硫辛酰胺插入E1的通道，进入活性位点 3. E1催化，将乙酰基转移到硫辛酰胺乙酰化的臂离开 E1，进入E2的空心体内亚基界面之间的活性位点 4. 乙酰基转移给辅酶A，形成后离开多酶复合体还原 的硫辛酰胺摆渡到E3-黄素蛋白的活性位点 5. 在E3活性位点，硫辛酰胺被辅酶FAD氧化、重新生成 氧化型硫辛酰胺，可以进行另一轮反应 6. 还原型FADH2重新被氧化成FAD，同时将NAD+还原成 NADH（离开多酶复合体的最后一个产物） 图图17.9 17.9 丙酮酸脱氢酶复合物催化的反应丙酮酸脱氢酶复合物催化的反应。
柠檬酸合成酶催化、草酰乙酸和乙酰辅酶柠檬酸合成酶催化、草酰乙酸和乙酰辅酶A反应生成反应生成 柠檬酸柠檬酸 柠檬酸循环的起始是四碳单位（草酰乙酸）和二 碳单位(乙酰辅酶A的乙酰基)缩合草酰乙酸、乙酰辅 酶A和水一道反应，生成柠檬酸和辅酶A 这一反应由柠檬酸合成酶催化，包含两个反应步骤（先是醛缩反应，后是水解反应）草这一反应由柠檬酸合成酶催化，包含两个反应步骤（先是醛缩反应，后是水解反应）草 酰乙酸先和乙酰辅酶酰乙酸先和乙酰辅酶A缩合形成柠檬酰辅酶缩合形成柠檬酰辅酶A柠檬酰辅酶柠檬酰辅酶A有从乙酰辅酶有从乙酰辅酶A带来的硫酯键带来的硫酯键 ，是一个高能分子柠檬酰辅酶，是一个高能分子柠檬酰辅酶A水解生成柠檬酸和辅酶水解生成柠檬酸和辅酶A，驱动整个反应朝柠檬酸合成，驱动整个反应朝柠檬酸合成 的方向进行实际上，硫脂水解释放的自由能驱使两个前体分子（草酰乙酸和乙酰辅酶的方向进行实际上，硫脂水解释放的自由能驱使两个前体分子（草酰乙酸和乙酰辅酶A ）合成两个新分子（柠檬酸和辅酶）合成两个新分子（柠檬酸和辅酶A） 哺乳柠檬酸合成酶是二聚体两亚基相同，大小为49 kd每个 亚基有两个结构域，大结构域(蓝色)和小结构域(黄色)之间有一个裂 缝，与亚基间界面毗邻。
酶与两个底物有序结合，先是草酰乙酸、 后是乙酰辅酶A有序结合的原因在于草酰乙酸结合诱导该酶结构 重排(从开放形式转变为关闭形式)，进而形成乙酰辅酶A的结合位点 此过程中，小结构域旋转19，移动15产生乙酰辅酶A结合 位点底物结合使裂缝关闭与己糖激酶裂缝关闭类似 柠檬酸合成酶的催化缩合机制：将两 个底物置于相邻位置、有序排列并激化相 应的化学键（图17.11）质子的供给和除 去将乙酰辅酶A转化成成烯醇式中间体 烯醇攻击草酰乙酸使乙酰辅酶A和草酰乙 酸之间形成一个碳碳双键新形成的柠檬 酰辅酶A诱导合成酶蛋白结构发生变化， 导致活性位点完全关闭合成酶水解柠檬 酰CoA之间的酯键辅酶A先离开该酶， 接着柠檬酸也离开柠檬酸合成酶恢复最 初的开放式构象 图图17.11 柠檬酸合成酶催化合成柠檬酰柠檬酸合成酶催化合成柠檬酰CoA的机制1）在底物复 合体（左）中，His274提供质子给乙酰CoA的羰基O，使Asp375夺 取乙酰辅酶A甲基的一个氢离子，形成烯醇式乙酰CoA中间体（中 ）2）His320提供质子给草酰乙酸的羰基碳原子，活化草酰乙酸 3）同时，乙酰CoA的烯醇供给草酰乙酸的羰基，使乙酰辅酶A 与草酰乙酸之间形成碳-碳连接。
His274重新获得质子，形成柠檬酰 CoAHis274后来又提供质子，参与硫酯键水解反应（产生柠檬酸 和CoA，此处没有介绍这个反应） 现在可以理解乙酰CoA的水解反应是怎样被阻 止的 柠檬酸合成酶的构象非常适宜水解柠檬酰 CoA，但不适宜水解乙酰CoA如何实现这样的 选择性？首先，柠檬酸合成酶与草酰乙酸结合 后才能结合乙酰CoA，结合的乙酰辅酶。