生物化学与分子生物学实验教学中心血清清蛋白、g-球蛋白的分离、提纯与鉴定1 生物化学与分子生物学实验教学中心内 容实验目的实验目的1实验原理实验原理2实验材料实验材料3实验过程实验过程45注意事项注意事项 生物化学与分子生物学实验教学中心实验目的1.1.掌握掌握盐析法盐析法分离蛋白质的原理和基本方法分离蛋白质的原理和基本方法2.2.掌握掌握凝胶层析法凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法分离蛋白质的原理和基本方法3.3.掌握掌握离子交换层析法离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法分离蛋白质的原理和基本方法4.4.掌握掌握醋酸纤维素薄膜电泳法醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法的原理和基本方法5.5.了解柱层析技术了解柱层析技术 生物化学与分子生物学实验教学中心实验原理v蛋白质的蛋白质的分离和纯化分离和纯化是研究蛋白质化学及其生是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段物学功能的重要手段v不同蛋白质的不同蛋白质的分子量分子量、、溶解度溶解度及及等电点等电点等都有等都有所不同利用这些性质的差别，可分离纯化所不同利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质各种蛋白质 生物化学与分子生物学实验教学中心蛋白质的理化性质与常用的分离纯化方法 生物化学与分子生物学实验教学中心血清蛋白的等电点、平均分子量及正常含量血清蛋白的等电点、平均分子量及正常含量清蛋白清蛋白 A 生物化学与分子生物学实验教学中心1. 粗提（盐析法）v由于血清中各种蛋白质分子的由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带颗粒大小、所带电荷的多少电荷的多少和和亲水程度亲水程度不同，故盐析所需的盐不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。
浓度也不一样v调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的分离的目的血清清蛋白血清清蛋白球蛋白球蛋白半饱和硫酸铵半饱和硫酸铵清蛋白不沉淀，上清清蛋白不沉淀，上清球蛋白沉淀球蛋白沉淀 生物化学与分子生物学实验教学中心2. 脱盐（凝胶层析）v盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必须盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必须先脱盐后才能进一步纯化先脱盐后才能进一步纯化v脱盐有多种方法，本实验采用脱盐有多种方法，本实验采用凝胶层析法凝胶层析法v凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质分子大分子大小的不同小的不同而将其分离的技术而将其分离的技术 生物化学与分子生物学实验教学中心凝凝胶胶层层析析分分离离化化合合物物示示意意图图 生物化学与分子生物学实验教学中心3.纯化（离子交换层析）v离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，离子进行可逆的交换，利用化合物的利用化合物的电荷性质电荷性质及及电荷量不同电荷量不同进行分离进行分离R-SO3-H+ + Pr+R-SO3-Pr+ + H+阳离子交换阳离子交换阴离子交换阴离子交换R-N+R3OH- + Pr -R-N+R3Pr - + OH- 生物化学与分子生物学实验教学中心 生物化学与分子生物学实验教学中心DEAE-DEAE-纤维素（二乙基氨基乙基纤维素（二乙基氨基乙基- -纤维素）纤维素）v分子带电形式：分子带电形式： 纤维素纤维素-OC-OC2 2H H4 4N N+ +H(CH(C2 2H H5 5) )v阴离子交换剂阴离子交换剂 0.06mol/LNH4AcpH6.5DEAE-纤维素清蛋白清蛋白pI 4.9，带，带负电荷多负电荷多a a、、b b球蛋白球蛋白pI 5.0～～5.2，，带带负电荷少负电荷少a a、、b b球蛋白被洗脱球蛋白被洗脱,清蛋白仍被吸附清蛋白仍被吸附0.02mol/LNH4AcpH6.5DEAE-纤维素清蛋白及清蛋白及a a、、b b球蛋白的球蛋白的pI＜＜6.5 ，带，带负电荷负电荷g g–球蛋白球蛋白pI ＞＞6.5，，带带正电荷正电荷清蛋白及清蛋白及a a、、b b球蛋白球蛋白被层析柱吸附被层析柱吸附,g g-球蛋白被洗脱球蛋白被洗脱0.3mol/LNH4Ac pH6.5DEAE-纤维素缓冲液离子强度增加缓冲液离子强度增加清蛋白被洗脱清蛋白被洗脱 生物化学与分子生物学实验教学中心磺基水杨酸检测蛋白质磺基水杨酸检测蛋白质v蛋白质为两性物质，在酸性环境中带正电荷，而蛋白质为两性物质，在酸性环境中带正电荷，而磺基水杨酸根带负电，正好与蛋白质结合磺基水杨酸根带负电，正好与蛋白质结合沉淀沉淀，，显示液体中有蛋白存在。
显示液体中有蛋白存在v注意：磺基水杨酸正好使液体呈酸性，促使二者注意：磺基水杨酸正好使液体呈酸性，促使二者结合v此法常用来检测微量人体蛋白，如尿液、脑脊液此法常用来检测微量人体蛋白，如尿液、脑脊液等是否有蛋白渗漏等是否有蛋白渗漏 4.蛋白性质鉴定（沉淀法） 生物化学与分子生物学实验教学中心醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳血浆中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于血浆中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4pH7.4它们在在pH8.6pH8.6的缓冲液中均解离带的缓冲液中均解离带负电荷负电荷，在电场中向正极移，在电场中向正极移动由于血浆中各种蛋白质由于血浆中各种蛋白质分子大小分子大小、、形状形状及所带的及所带的电荷量电荷量不同，不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同因此可以将因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同因此可以将它们分离为它们分离为清蛋白（清蛋白（Albumin)Albumin)、、αα1 1- -球蛋白、球蛋白、αα2 2- -球蛋白、球蛋白、β-β-球蛋白、球蛋白、γ-γ-球蛋白球蛋白5 5条区带5.纯度鉴定（电泳） 生物化学与分子生物学实验教学中心血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳结果血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳结果 生物化学与分子生物学实验教学中心三、实验材料v健康人血清健康人血清v葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（G-25)G-25)层析柱层析柱vDEAEDEAE纤维离子交换层析柱纤维离子交换层析柱v饱和硫酸铵溶液饱和硫酸铵溶液v20%20%磺基水杨酸磺基水杨酸v1%BaCl1%BaCl2 2溶液溶液v电泳仪、电泳槽电泳仪、电泳槽 生物化学与分子生物学实验教学中心四、实验过程盐析法进盐析法进盐析法进盐析法进行粗分离行粗分离行粗分离行粗分离DEAEDEAEDEAEDEAE纤维素离纤维素离纤维素离纤维素离子交换层析子交换层析子交换层析子交换层析粗提粗提粗提粗提脱盐脱盐脱盐脱盐纯化纯化纯化纯化醋酸纤维素醋酸纤维素醋酸纤维素醋酸纤维素薄膜电泳薄膜电泳薄膜电泳薄膜电泳鉴定鉴定鉴定鉴定葡聚糖凝葡聚糖凝葡聚糖凝葡聚糖凝胶层析胶层析胶层析胶层析 用用1ml 0.02mol/L NH4AC缓缓冲冲液液清清洗层析柱内壁洗层析柱内壁, 取取血血清清0.8ml，，边边摇摇边边缓缓慢慢滴滴加加饱饱和和硫硫酸酸铵铵溶溶液液0.8ml，，混匀室温放置混匀室温放置10min，，4000r/min离心离心10min沉淀（含球蛋白）加水沉淀（含球蛋白）加水 0.6ml溶解溶解上清液（含清蛋白、少量上清液（含清蛋白、少量α球蛋白和球蛋白和β球蛋白）约球蛋白）约0.8ml用用1ml 0.02mol/L NH4AC缓缓冲冲液液清清洗层析柱内壁洗层析柱内壁, 凝凝 胶胶 柱柱 层层 析析 除除 盐盐继继续续用用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓缓冲液冲液(2ml)洗脱，流出液量约洗脱，流出液量约2ml磺基水杨酸检测蛋白质收集含有蛋白质的峰液收集含有蛋白质的峰液 12d此时磺基水杨酸和BaClBaCl2 2检测可能同时阳性继继续续用用0.02mol/L NH4AC缓缓冲冲液液洗涤约洗涤约2mlBaCl2检测SO42-阴性用用2~3ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液再生平衡缓冲液再生平衡过葡聚糖凝胶过葡聚糖凝胶G-25层析柱层析柱（（1.0×7cm））过葡聚糖凝胶过葡聚糖凝胶G-25层析柱层析柱（（1.0×7cm））继继续续用用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓缓冲液洗脱，流出液量约冲液洗脱，流出液量约2ml磺基水杨酸检测蛋白质收集含有蛋白质的峰液收集含有蛋白质的峰液 12d此时磺基水杨酸和BaClBaCl2 2检测可能同时阳性继继续续用用0.02mol/L NH4AC缓缓冲冲液液洗涤约洗涤约2mlBaCl2检测SO42-阴性用用2~3ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液再生平衡缓冲液再生平衡盐盐析析操作流程操作流程离子交换柱层析纯化离子交换柱层析纯化加样加样加样加样 用用1ml 0.0６６mol/L NH4AC缓缓冲冲液液清洗层析柱内壁清洗层析柱内壁, 离 子 交 换 柱 层 纯 化除盐后收集的清蛋白除盐后收集的清蛋白用用1ml 0.02mol/L NH4AC缓缓冲冲液液清清洗层析柱内壁洗层析柱内壁, 取取浓浓度度最最高高的的1管管作作纯纯度度鉴鉴定定（醋酸纤维素薄膜电泳法）（醋酸纤维素薄膜电泳法）继继续续用用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓缓冲液冲液(3ml)洗脱，流出液量约洗脱，流出液量约2ml磺基水杨酸检测蛋白质收收集集含含有有球球蛋蛋白白的的洗洗脱脱液液每管每管10d，连续收集，连续收集3管管DEAE-纤纤维维素素柱柱不不用用再再生生，，可直接用于纯化清蛋白可直接用于纯化清蛋白除盐后收集的球蛋白除盐后收集的球蛋白过过DEAE-纤维素层析柱纤维素层析柱（（1.0×6cm））过过DEAE-纤维素层析柱纤维素层析柱（（1.0×6cm））用用约约５５mL 0.06mol/L NH4AC缓缓冲冲液液流流洗洗，，除去除去α球蛋白和球蛋白和β球蛋白球蛋白用用0.3mol/L NH4AC缓缓冲冲液液(约约3ml)洗洗脱脱，，流出液量约流出液量约2.5ml磺基水杨酸检测蛋白质收收集集含含有有清清蛋蛋白白的的洗洗脱脱液液每管每管10d，连续收集，连续收集2管管DEAE-纤纤维维素素柱柱先先用用6ml l.5mol/L NaCl - 0.3mol/L NH4AC溶溶液液流流洗洗，，再再用用10ml 0.02mol/L NH4AC缓缓冲液流洗再生平衡冲液流洗再生平衡离子交换柱再生和蛋白纯度鉴定2管均作纯度鉴定管均作纯度鉴定(醋酸纤维素薄膜电泳法醋酸纤维素薄膜电泳法)操作流程操作流程 生物化学与分子生物学实验教学中心五、注意事项v所用血清应新鲜，无沉淀物及细菌滋生。
所用血清应新鲜，无沉淀物及细菌滋生v上样时，滴管应沿柱上端内壁加入样品，动作应上样时，滴管应沿柱上端内壁加入样品，动作应轻轻、、慢慢，，勿将柱床冲起勿将柱床冲起流洗平衡时亦应如此流洗平衡时亦应如此v上样柱高！上样柱高！v洗脱时应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失，洗脱时应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失，并并注意层析柱不要流干，进入空气注意层析柱不要流干，进入空气v切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查SOSO4 42-2-的的BaClBaCl2 2混淆，混淆，因二者与相应物质生成的沉淀均为白色因二者与相应物质生成的沉淀均为白色v葡聚糖凝胶价钱昂贵，要回收再生葡聚糖凝胶价钱昂贵，要回收再生, ,避免损耗，避免损耗，严禁倒掉严禁倒掉! ! 生物化学与分子生物学实验教学中心醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳 1. 点样点样(粗面粗面)8cm2cm点样线点样区1.5cm(粗面）点样线点样线尽量点得细窄而均匀尽量点得细窄而均匀, ,宁少勿多宁少勿多－－＋＋小组标记小组标记样品标记样品标记 生物化学与分子生物学实验教学中心醋酸纤维素薄膜电泳2. 2. 电泳电泳①①薄膜薄膜粗面向下粗面向下②②点样端点样端置阴极端置阴极端③③两端紧贴在滤纸盐桥上，两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平膜应轻轻拉平膜应轻轻拉平膜应轻轻拉平④④注意：注意：切勿使点样处与电泳槽接触切勿使点样处与电泳槽接触电压：电压：110V110V时间：时间：50min50min。
生物化学与分子生物学实验教学中心 3. 3. 染色和漂洗染色和漂洗 电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中浸于染色液中5min5min 取出膜，取出膜，尽量沥净染色液尽量沥净染色液，移入漂洗液中，移入漂洗液中浸洗脱色（一般更换浸洗脱色（一般更换2 2次），次），至背景颜色脱净为止至背景颜色脱净为止 取出膜，用滤纸吸干即可取出膜，用滤纸吸干即可醋酸纤维素薄膜电泳 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验结果-+血清血清清蛋白第清蛋白第1 1管管清蛋白第清蛋白第2 2管管γ-γ-球蛋白管球蛋白管点点样样线线Aγ-α1α2β 生物化学与分子生物学实验教学中心思考题v1.1.硫酸铵盐析一步硫酸铵盐析一步, ,为什么是为什么是0.8ml0.8ml血清加血清加0.8ml0.8ml饱和硫酸饱和硫酸铵铵? ?v2.2.为什么实验中为什么实验中DEAEDEAE纤维素柱分离纤维素柱分离γ-γ-球蛋白后不用再生球蛋白后不用再生, ,可直接用于纯化清蛋白可直接用于纯化清蛋白? ?v3.3.应用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定分离纯化后的血清清蛋白应用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定分离纯化后的血清清蛋白和和γ-γ-球蛋白的纯度球蛋白的纯度, ,根据什么来确定它是清蛋白还是根据什么来确定它是清蛋白还是γ-γ-球蛋白球蛋白? ?判定它们纯度的依据是什么判定它们纯度的依据是什么? ? 南方医科大学南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心28 。