核酸提取及常见问题分析核酸提取及常见问题分析 第一部分：第一部分：DNA提取方法简介提取方法简介第二部分：第二部分：DNA提取常见问题、提取常见问题、 缘由分析及其对策 缘由分析及其对策内容内容第三部分：第三部分：RNA提取方法简介提取方法简介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常见常见 问题、缘由分析及其对策问题、缘由分析及其对策 核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研讨的主要对象，因此核分子，是分子生物学研讨的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最根本的操作根本的操作 前言前言 第一部分：第一部分：DNA提取方法简介提取方法简介第二部分：第二部分：DNA提取常见问题、提取常见问题、 缘由分析及其对策 缘由分析及其对策第三部分：第三部分：RNA提取方法简介提取方法简介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常见常见 问题、缘由分析及其对策问题、缘由分析及其对策第一部分：第一部分：DNA提取方法简介提取方法简介 DNA提取的几种方法提取的几种方法q 基因组 基因组DNADNA的提取的提取Ø CTAB法法Ø SDS法法Ø 其它 其它 DNA提取的几种方法提取的几种方法q 非基因组 非基因组DNADNA的提取的提取Ø 质粒 质粒DNADNA的提取的提取• 碱裂解法碱裂解法• 煮沸法 煮沸法 Ø 线粒体、叶绿体 线粒体、叶绿体DNADNA的提取的提取• 差速离心结合差速离心结合SDS裂解法裂解法 基因基因组DNA－－ CTAB法法q CTABCTAB法原理〔植物法原理〔植物DNADNA提取经典提取经典方法〕方法〕ØCTAB〔〔hexadecyltrimethylammonium bromide，十六，十六烷烷基三甲基基三甲基溴化溴化铵铵〕，是一种阳离子去〕，是一种阳离子去污剂污剂，可溶解，可溶解细细胞膜，并与核酸构成复合胞膜，并与核酸构成复合物。
物Ø该该复合物在高复合物在高盐盐溶液中〔溶液中〔>0.7mol/L NaCl〕是可溶的，〕是可溶的，经过经过有机溶有机溶剂剂抽提，去除蛋白、多糖、酚抽提，去除蛋白、多糖、酚类类等等杂质杂质后参与乙醇沉淀即可使核酸分后参与乙醇沉淀即可使核酸分别别出来注：注：CTAB溶液在低于溶液在低于15℃℃ 时会构成沉淀析出，因此在将其参与冰冷的会构成沉淀析出，因此在将其参与冰冷的 植物植物资料之前必需料之前必需预热，且离心，且离心时温度不要低于温度不要低于15℃℃ q CTABCTAB提取缓冲液的经典配方提取缓冲液的经典配方 组份组份 Tris-HCl 〔〔pH8.0〕〕 EDTA 〔〔pH8.0〕〕 NaCl CTABβ-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%〔〔V/V〕运用前参〕运用前参与与ØTris-HCl 〔〔pH8.0〕提供一个〕提供一个缓冲冲环境，防止核酸被破坏；境，防止核酸被破坏；ØEDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNase活性；活性；ØNaCl 提供一个高提供一个高盐环境，使境，使DNP充分溶解，存在于液相中；充分溶解，存在于液相中；ØCTAB溶解溶解细胞膜，并胞膜，并结合核酸，使核酸便于分合核酸，使核酸便于分别；；Øβ-巯基乙醇是抗氧化基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成，有效地防止酚氧化成醌，防止褐，防止褐变，使酚容易去除，使酚容易去除基因基因组DNA－－ CTAB法法 q CTABCTAB提取缓冲液的改良配方提取缓冲液的改良配方 组份组份 Tris-HCl 〔〔pH8.0〕〕 EDTA 〔〔pH8.0〕〕NaCl CTAB PVP40β-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%〔〔V/V〕〕运用前参与运用前参与vPVP〔聚乙烯吡咯烷酮〕是酚的络合物，能与多酚构成一种不溶〔聚乙烯吡咯烷酮〕是酚的络合物，能与多酚构成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
和多糖结合，有效去除多糖基因基因组DNA－－ CTAB法法 q CTABCTAB法流程图法流程图植物资料植物资料裂解液裂解液上层溶液上层溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提细胞裂解细胞裂解枯燥溶解枯燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液基因基因组DNA－－ CTAB法法 q SDS SDS法原理法原理基因基因组DNA－－SDS法法ØSDS是是一一种种阴阴离离子子去去垢垢剂，，在在高高温温〔〔55～～65℃℃〕〕条条件件下下能能裂裂解解细胞胞，，使染色体离析，蛋白使染色体离析，蛋白变性，性，释放出核酸；放出核酸；Ø提提高高盐(KAc或或NH4Ac)浓度度并并降降低低温温度度〔〔冰冰浴浴〕〕，，使使蛋蛋白白质及及多多糖糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；沉淀，离心后除去沉淀；Ø上上清清液液中中的的DNA用用酚酚/氯仿仿抽抽提提，，反反复复抽抽提提后后用用乙乙醇醇沉沉淀淀水水相相中中的的DNA 组份 组份Tris-HCl 〔〔pH8.0〕〕 EDTA 〔〔pH 8.0 〕〕 NaCl SDS 终浓度 终浓度 10 mM 20 mM 0.4M 2%q SDS SDS法法DNADNA提取缓冲液提取缓冲液 q SDS SDS法流程图法流程图 〔以动物组〔以动物组织为例〕织为例〕 动物组织动物组织细胞裂解细胞裂解上层溶液上层溶液组织匀浆组织匀浆抽提抽提枯燥溶解枯燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液基因基因组DNA－－SDS法法 基因基因组DNA－其它方法－其它方法Ø 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法Ø 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法Ø 生物方式：酶法 生物方式：酶法q 根据细胞裂解方式的不同有： 根据细胞裂解方式的不同有： 基因基因组DNA－其它方法－其它方法Ø 吸附资料结合法： 吸附资料结合法：q 根据核酸分别纯化方式的不同有： 根据核酸分别纯化方式的不同有：• 硅质资料 硅质资料• • 阴离子交换树脂 阴离子交换树脂• 磁珠 磁珠高盐低高盐低pHpH值结合核酸，低盐高值结合核酸，低盐高pHpH值洗脱。
值洗脱快捷高效快捷高效低盐高低盐高pHpH值结合核酸，高盐低值结合核酸，高盐低pHpH值洗脱适用于纯度要求高的实验适用于纯度要求高的实验磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而到达分别目的物，从而到达分别目的 基因基因组DNA－其它方法－其它方法Ø 浓盐法： 浓盐法：Ø Ø Ø 有机溶剂抽提法： 有机溶剂抽提法：Ø Ø Ø 密度梯度离心法： 密度梯度离心法：Ø 利用利用RNP和和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分别在盐溶液中溶解度不同，将二者分别有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分别各种内容物利用不同内容物密度不同的原理分别各种内容物 质粒粒DNA－碱裂解法－碱裂解法q 碱裂解法原理 碱裂解法原理Ø染色体染色体DNA比质粒比质粒DNA分子大得多，且染色体分子大得多，且染色体DNA为线为线状分子，而质粒状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；为共价闭合环状分子；Ø当用碱处置当用碱处置DNA溶液时，线状染色体溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，容易发生变性，共价闭环的质粒共价闭环的质粒DNA在回到中性在回到中性pH时即恢复其天然构象；时即恢复其天然构象；Ø变性染色体变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合构成沉片段与变性蛋白质和细胞碎片结合构成沉淀，而复性的超螺旋质粒淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子那么以溶解形状存在分子那么以溶解形状存在液相中，从而可经过离心将两者分开。
液相中，从而可经过离心将两者分开 质粒粒DNA－碱裂解法－碱裂解法q 碱裂解法流程图 碱裂解法流程图对数期菌体对数期菌体溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重悬充分重悬溶液溶液II裂解裂解上清液上清液抽提抽提离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀枯燥溶解枯燥溶解沉淀沉淀质粒质粒DNA溶液溶液 质粒粒DNA－煮沸法－煮沸法q 煮沸法原理 煮沸法原理Ø染色体染色体DNA比质粒比质粒DNA分子大得多，且染色体分子大得多，且染色体DNA为线为线状分子，而质粒状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；为共价闭合环状分子；Ø当加热处置当加热处置DNA溶液时，线状染色体溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，容易发生变性，共价闭环的质粒共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；在冷却时即恢复其天然构象；Ø变性染色体变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合构成沉片段与变性蛋白质和细胞碎片结合构成沉淀，而复性的超螺旋质粒淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子那么以溶解形状存在分子那么以溶解形状存在液相中，从而可经过离心将两者分开液相中，从而可经过离心将两者分开 细胞器胞器DNA－差速离心法－差速离心法q 差速离心法原理 差速离心法原理Ø是利用物质比重的不同分别混合物的一种方法。
是利用物质比重的不同分别混合物的一种方法Ø将待分别物质置于均匀介质〔蔗糖〕中，以一定的转速进将待分别物质置于均匀介质〔蔗糖〕中，以一定的转速进展离心，比艰苦的物质优先沉降，比重小的却处于上层，展离心，比艰苦的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分别从而得以分别 线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，本身可编码蛋 线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，本身可编码蛋白，它们的比重和大小一定，因此在同一离心场内的沉降速度白，它们的比重和大小一定，因此在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分别出来种组分分级分别出来 第一部分：第一部分：DNA提取方法简介提取方法简介第二部分：第二部分：DNA提取常见问题、提取常见问题、 缘由分析及其对策 缘由分析及其对策内容内容第三部分：第三部分：RNA提取方法简介提取方法简介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常见常见 问题、缘由分析及其对策问题、缘由分析及其对策第二部分：第二部分：DNA提取常见问题、提取常见问题、 缘由分析及其对策 缘由分析及其对策 DNA提取的根本步提取的根本步骤I.I.资料料预备II.II.破碎破碎细胞或包膜－内容物胞或包膜－内容物释放放III.III.核酸分核酸分别、、纯化化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.V.核酸溶解在适量核酸溶解在适量缓冲液或水中冲液或水中 资料料预备Ø最好运用新颖资料，低温保最好运用新颖资料，低温保管的样品资料不要反复冻融管的样品资料不要反复冻融Ø提取血液基因组提取血液基因组DNA时，要时，要选择有核细胞〔白细胞〕选择有核细胞〔白细胞〕Ø组培细胞培育时间不能过长，组培细胞培育时间不能过长，否那么会呵斥否那么会呵斥DNA降解降解Ø含病毒的液体资料含病毒的液体资料DNA含量含量较少，提取前先富集较少，提取前先富集基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取Ø运用途于对数期的新颖菌体〔老运用途于对数期的新颖菌体〔老化菌体导致开环质粒添加〕化菌体导致开环质粒添加〕Ø培育时应参与挑选压力，否那么培育时应参与挑选压力，否那么菌体易污染，质粒易丧失菌体易污染，质粒易丧失Ø尽量选择高拷贝的质粒，如为低尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，那么应加大菌拷贝或大质粒，那么应加大菌体用量体用量Ø菌株不要频繁转接〔质粒丧失〕菌株不要频繁转接〔质粒丧失〕 细胞裂解胞裂解Ø资料应适量，过多会影响裂解，资料应适量，过多会影响裂解，导致导致DNA量少，纯度低量少，纯度低Ø针对不同资料，选择适当的裂针对不同资料，选择适当的裂解预处置方式：解预处置方式：Ø植物资料－－液氮研磨植物资料－－液氮研磨Ø动物组织－－匀浆或液氮研磨动物组织－－匀浆或液氮研磨Ø组培细胞－－蛋白酶组培细胞－－蛋白酶KØ细菌－－溶菌酶破壁细菌－－溶菌酶破壁Ø酵母－－破壁酶或玻璃珠酵母－－破壁酶或玻璃珠Ø高温温浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取Ø菌体量适当菌体量适当Ø培育基去除干净，同时保证菌体培育基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮在悬浮液中充分悬浮Ø变性的时间不要过长〔变性的时间不要过长〔5分钟〕，分钟〕，否那么质粒易被打断否那么质粒易被打断Ø复性时间也不宜过长，否那么会复性时间也不宜过长，否那么会有基因组有基因组DNA的污染的污染ØG＋菌、酵母质粒的提取，应先＋菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处置，以破壁用酶法或机械法处置，以破壁 核酸分核酸分别、、纯化化Ø采用吸附资料吸附的方式分别采用吸附资料吸附的方式分别DNA时，应提供相时，应提供相应的缓冲体系应的缓冲体系Ø采用有机〔酚采用有机〔酚/氯仿〕抽提时应充分混匀，但动作氯仿〕抽提时应充分混匀，但动作要轻柔要轻柔Ø离心分别两相时，应保证一定的转速和时间离心分别两相时，应保证一定的转速和时间Ø针对不同资料的特点，在提取过程中辅以相应的针对不同资料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法去杂质的方法基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取 核酸分核酸分别、、纯化化q蛋白质的去除：蛋白质的去除：q酚酚/ /氯仿抽提氯仿抽提q运用变性剂变性〔运用变性剂变性〔SDSSDS、异硫、异硫氰酸胍等〕氰酸胍等〕q高盐洗涤高盐洗涤q蛋白酶处置蛋白酶处置 q多糖的去除：多糖的去除：q高高盐法：用乙醇沉淀法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液，在待沉淀溶液中参与中参与1/21/2体体积的的5M NaCl5M NaCl，高，高盐可溶解可溶解多糖。
多糖q用多糖水解用多糖水解酶将多糖降解将多糖降解q在提取在提取缓冲液中加一定量的冲液中加一定量的氯苯苯(1/2(1/2体体积) )，，氯苯可以与多糖的苯可以与多糖的羟基作用，从基作用，从而去除多糖而去除多糖 q用用PEG8000PEG8000替代乙醇沉淀替代乙醇沉淀DNADNA：在：在500μL 500μL DNADNA液中参与液中参与200μl 20% PEG8000 (200μl 20% PEG8000 (含含1.2 M NaCl) 1.2 M NaCl) ，冰浴，冰浴20min20min核酸分核酸分别、、纯化化 q多酚的去除：多酚的去除：q在抽提液中参与防止酚在抽提液中参与防止酚类氧化的氧化的试剂：：β-β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫硫苏糖醇等糖醇等q参与易与酚参与易与酚类结合的合的试剂：如：如PVPPVP、、PEGPEG( (聚乙二醇聚乙二醇) )，它，它们与酚与酚类有有较强的的亲和力，和力，可防止酚可防止酚类与与DNADNA的的结合合核酸分核酸分别、、纯化化q盐离子的去除：盐离子的去除：q7070％的乙醇洗涤％的乙醇洗涤 核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解Ø当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分淀会更充分Ø沉淀时参与沉淀时参与1/10体积的体积的NaAc〔〔pH5.2，，3M〕，有利于〕，有利于充分沉淀充分沉淀Ø沉淀后运用沉淀后运用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等％的乙醇洗涤，以除去盐离子等Ø晾干晾干DNA，让乙醇充分挥发〔不要过分枯燥〕，让乙醇充分挥发〔不要过分枯燥〕Ø假设长期储存建议运用假设长期储存建议运用TE缓冲液溶解缓冲液溶解ØTE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNaseØpH值为值为8.0，可防止，可防止DNA发生酸解发生酸解 基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取 1.1.DNADNA中含有蛋白、多中含有蛋白、多糖、多酚类杂质糖、多酚类杂质2.2.DNADNA在溶解前，有酒在溶解前，有酒精残留，酒精抑制精残留，酒精抑制后续酶解反响后续酶解反响3.3.DNADNA中残留有金属离中残留有金属离子子1.1.重新纯化重新纯化DNADNA，去除蛋，去除蛋白、多糖、多酚等杂白、多糖、多酚等杂质〔详细方法见前〕质〔详细方法见前〕2.2.重新沉淀重新沉淀DNADNA，让酒精，让酒精充分挥发充分挥发3.3.添加添加7070％乙醇洗涤的％乙醇洗涤的次数〔次数〔2-32-3次〕次〕DNA提取常提取常见问题q问题一：问题一：DNADNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和PCRPCR反反响。
响 缘由缘由对对策策 1.1.资料不新颖或反复冻资料不新颖或反复冻融融2.2.未很好抑制内源核酸未很好抑制内源核酸酶的活性酶的活性3.3.提取过程操作过于猛提取过程操作过于猛烈，烈，DNADNA被机械打断被机械打断4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染5.5.反复冻融反复冻融1.1.尽量取新颖资料，低温保管资料防尽量取新颖资料，低温保管资料防止反复冻融止反复冻融2.2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前参与裂解缓冲液前参与裂解缓冲液3.3.在提取内源核酸酶含量丰富的资料在提取内源核酸酶含量丰富的资料的的DNADNA时，可添加裂解液中螯合剂时，可添加裂解液中螯合剂的含量的含量4.4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5.5.一切试剂用无菌水配制，耗材经高一切试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌温灭菌6.6.将将DNADNA分装保管于缓冲液中，防止分装保管于缓冲液中，防止反复冻融反复冻融DNA提取常提取常见问题q问题二：问题二：DNADNA降解对对策策 缘由缘由 1.1.实验资料不佳或量少实验资料不佳或量少2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分3.3.沉淀不完全沉淀不完全4.4.洗涤时洗涤时DNADNA丧失丧失1.1.尽量选用新颖〔幼嫩〕的资尽量选用新颖〔幼嫩〕的资料料2.2.动植物要匀浆研磨充分；动植物要匀浆研磨充分；G G＋菌、酵母裂解前先用生物＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁酶或机械方式破壁3.3.高温裂解时，时间适当延伸高温裂解时，时间适当延伸〔对于动物细胞、细菌可添〔对于动物细胞、细菌可添加加PKPK的用量〕的用量〕4.4.低温沉淀，延伸沉淀时间低温沉淀，延伸沉淀时间5.5.加辅助物，促进沉淀加辅助物，促进沉淀6.6.洗涤时，最好用枪头将洗涤洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒液吸出，勿倾倒DNA提取常提取常见问题q问题三：问题三：DNADNA提取量少。
提取量少对对策策 缘由缘由 第一部分：第一部分：DNA提取方法简介提取方法简介第二部分：第二部分：DNA提取常见问题、提取常见问题、 缘由分析及其对策 缘由分析及其对策内容内容第三部分：第三部分：RNA提取方法简介提取方法简介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常见常见 问题、缘由分析及其对策问题、缘由分析及其对策第三部分：第三部分：RNA提取方法简介提取方法简介 RNA提取的通用方法提取的通用方法q 异硫氰酸胍 异硫氰酸胍/ /苯酚法苯酚法Ø 原理：原理：Ø细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；上的蛋白变性，核酸释放；Ø释放出来的释放出来的DNADNA和和RNARNA由于在特定由于在特定pHpH下溶解度的不同而下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分别；分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分别；Ø有机溶剂抽提，沉淀，得到纯真有机溶剂抽提，沉淀，得到纯真RNARNA RNA提取的通用方法提取的通用方法 q 异硫氰酸胍 异硫氰酸胍/ /苯酚法苯酚法Ø 步骤步骤: :Ø资料预备：尽量新颖。
资料预备：尽量新颖Ø裂解变性：异硫氰酸胍〔亚硫氢胍，巯基乙醇，裂解变性：异硫氰酸胍〔亚硫氢胍，巯基乙醇，N-N-月桂肌月桂肌氨酸等〕氨酸等〕Ø 使细胞及核蛋白复合物变性，释放使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNARNA，有效抑，有效抑制核酸酶制核酸酶Ø纯化分别：苯酚，氯仿，异戊醇苯酚纯化分别：苯酚，氯仿，异戊醇苯酚/ /氯仿可抽提去除杂氯仿可抽提去除杂物Ø洗涤：洗涤：7070％乙醇Ø沉淀：异丙醇、无水乙醇沉淀：异丙醇、无水乙醇Ø 乙酸钠〔乙酸钠〔pH4.0pH4.0〕：维持变性的细胞裂解液的〕：维持变性的细胞裂解液的pHpH值，值，沉淀沉淀RNARNAØ 此外还常用氯化锂选择沉淀此外还常用氯化锂选择沉淀RNARNARNA提取的通用方法提取的通用方法 影响影响RNA提取的要素提取的要素q 资料：料：q新新颖，切忌运用反复，切忌运用反复冻融的融的资料料q如假如假设资料来源困料来源困难，且，且实验需求一定的需求一定的时间间隔可以先将隔可以先将资料料储存在存在TRIzolTRIzol或或样品品储存液中，于－存液中，于－70℃70℃或－或－20℃20℃保管保管q如要多次提取，如要多次提取，请分成多份保管分成多份保管q液氮液氮长期保管，－期保管，－70℃70℃短期保管短期保管影响影响RNA提取的要素提取的要素 影响影响RNA提取的要素提取的要素q 样品破碎及裂解：样品破碎及裂解：q根据不同资料选择不同的处置方法：根据不同资料选择不同的处置方法：q培育细胞：通常可直接加裂解液裂解培育细胞：通常可直接加裂解液裂解q酵母和细菌：普通酵母和细菌：普通TRIzolTRIzol可直接裂解，对可直接裂解，对于一些特殊的资料可先用酶或者机械方法于一些特殊的资料可先用酶或者机械方法破壁破壁q动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。
期间动作快速，样品坚持冷冻解液裂解期间动作快速，样品坚持冷冻q样品量适当，保证充分裂解样品量适当，保证充分裂解q为减少为减少DNADNA污染，可适当加大裂解液的污染，可适当加大裂解液的用量用量影响影响RNA提取的要素提取的要素 q 纯化：纯化：q在运用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，在运用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；且动作快速；q经典的纯化方法，如经典的纯化方法，如 LiCl LiCl 沉淀等，虽然沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易呵斥经济，但操作时间长，易呵斥 RNA RNA 降解；降解；q柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响去除影响 RNA RNA 后续酶反响的杂质，是目后续酶反响的杂质，是目前较为理想的选择前较为理想的选择影响影响RNA提取的要素提取的要素 第一部分：第一部分：DNA提取方法简介提取方法简介第二部分：第二部分：DNA提取常见问题、提取常见问题、 缘由分析及其对策 缘由分析及其对策内容内容第三部分：第三部分：RNA提取方法简介提取方法简介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常见常见 问题、缘由分析及其对策问题、缘由分析及其对策第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常见常见 问题、缘由分析及其对策问题、缘由分析及其对策 RNA提取常提取常见问题q RNA RNA 的降解的降解 q OD260 /OD280 OD260 /OD280 比值偏低比值偏低q 电泳带型异常电泳带型异常q 下游实验效果不佳下游实验效果不佳 RNA降解降解q 新颖细胞或组织：新颖细胞或组织：q裂解液的质量裂解液的质量q外源外源RNaseRNase的污染的污染q裂解液的用量缺乏裂解液的用量缺乏q组织裂解不充分组织裂解不充分q另另外外某某些些富富含含内内源源酶酶的的样样品品 ( (如如脾脾脏脏，，胸胸腺腺等等) )，很难防止，很难防止 RNA RNA 的降解。
的降解q 建建议议在在液液氮氮条条件件下下将将组组织织碾碾碎碎，，并并且且匀匀浆浆时运用更多裂解液时运用更多裂解液 RNA降解降解q 冷冷冻样品：品：q样品品取取材材后后应立立刻刻置置于于液液氮氮中中速速冻，，然然后后可可以以移移至至-70℃-70℃冰冰箱箱保保管管样品品要要相相对小一点；小一点；q先用液氮研磨，再加裂解液匀先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；；q样品品与与裂裂解解液液充充分分接接触触前前防防止止融融化化，，研研磨磨器器具具必必需需预冷冷，，碾碾磨磨过程程中中及及时补充液氮 OD260 /OD280 OD260 /OD280 比值偏比值偏低低q 蛋白质污染：q不要吸入中间层及有机相，参与氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够q减少起始样品量，确保裂解完全、彻底q处理方法:重新抽提一次，再沉淀，溶解q 苯酚残留：q不要吸入中间层及有机相，参与氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够q处理方法:重新抽提一次，再沉淀，溶解 OD260 /OD280 OD260 /OD280 比值偏比值偏低低q 抽提试剂残留：抽提试剂残留：q确确保保洗洗涤涤时时要要彻彻底底悬悬浮浮 RNARNA，，并并且且彻彻底底去去掉掉 75% 75% 乙醇。
乙醇q处理方法处理方法: :再沉淀一次后，溶解再沉淀一次后，溶解q 设备限制：设备限制：q测测定定OD260 OD260 及及OD280 OD280 数数值值时时，，要要使使OD260 OD260 读数在读数在 0.10 - 0.50 0.10 - 0.50 之间此范围线性最好此范围线性最好q 用水稀释样品：用水稀释样品：q测测 OD OD 时时，，对对照照及及样样品品稀稀释释液液请请运运用用 10 10 mM mM TrisTris，，pH pH 7.57.5用用水水作作为为稀稀释释液液将将导导致致比比值值的降低 电泳泳带型异常型异常q 非变性电泳：非变性电泳：q上样量超越上样量超越 3ug 3ug，电压超越，电压超越 6V/cm 6V/cm，，电泳缓冲液陈旧，均能够导致电泳缓冲液陈旧，均能够导致 28S 28S 和和 18S 18S 条带分不开条带分不开q 变性电泳条带变淡：变性电泳条带变淡：q EB EB 与单链的结合才干要差一些，故同与单链的结合才干要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；淡一些；q甲醛的质量不高甲醛的质量不高 。
下游下游实验效果不佳效果不佳q RNA 降解 q 抽提试剂的残留 q 75% 乙醇洗涤 q 样品中杂质的残留q 多糖等杂质，再次沉淀 q DNA 污染 q 运用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提RNA RTRT常见问题分析和处理方案常见问题分析和处理方案问题一：少量或没有问题一：少量或没有RT-PCRRT-PCR产物产物RNARNA降解降解分别无污染，高质量的分别无污染，高质量的RNARNA；防止；防止RNARNA降解降解RNARNA中含逆转录酶抑制剂中含逆转录酶抑制剂7070％〔％〔v/vv/v〕乙醇清洗〕乙醇清洗RNARNA沉淀，除去抑制剂沉淀，除去抑制剂起始起始RNARNA量太低量太低添加添加RNARNA的量的量 多糖同多糖同RNARNA共沉淀共沉淀用氯化锂沉淀用氯化锂沉淀RNARNA以除去多糖以除去多糖合成合成cDNAcDNA第一链合成的引物第一链合成的引物退火失败退火失败确定退火温度适宜所用的引物确定退火温度适宜所用的引物RNARNA模板存在较多二级构造模板存在较多二级构造将将RNARNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/ /退火，退火，提高逆转录反响温度提高逆转录反响温度反转录胜利，反转录胜利，PCRPCR失败失败PCRPCR步骤中运用超越步骤中运用超越1/51/5的逆转录反响产物的逆转录反响产物能够缘由能够缘由处理方案处理方案 RTRT常见问题分析和处理方案常见问题分析和处理方案问题二：有非特异性带问题二：有非特异性带q 引物和模板的非特异性退火引物和模板的非特异性退火 q 基因特异性引物设计较差基因特异性引物设计较差 q RNA RNA中有基因组中有基因组DNADNA的污染的污染 q 构成引物二聚体构成引物二聚体 q 镁离子浓度太高镁离子浓度太高 提高反响的温度和特异性提高反响的温度和特异性 提高引物的特异性提高引物的特异性 运用运用扩增增级DNaseⅠDNaseⅠ处置置RNA RNA 设计在在3'3'端没有互端没有互补序列的引物序列的引物 优化化镁离子离子浓度度 能够缘由能够缘由处理方案处理方案 RTRT常见问题分析和处理方案常见问题分析和处理方案问题三：产生弥散〔问题三：产生弥散〔smearsmear〕条带〕条带 q 第一链产物的含量过高第一链产物的含量过高 q PCR PCR反响中引物过多反响中引物过多 q 循环数过多循环数过多 q 退火温度过低退火温度过低 q 寡核苷酸片段产生的非特异性扩增寡核苷酸片段产生的非特异性扩增 常规常规PCRPCR步骤中减少第一链产物的量步骤中减少第一链产物的量减少引物的用量减少引物的用量 减少减少PCRPCR的循环次数的循环次数 提高退火温度提高退火温度 提取高质量提取高质量RNARNA，防止被，防止被DNADNA污染污染 能够缘由能够缘由处理方案处理方案RTRT常见问题分析和处理方案常见问题分析和处理方案RTRT常见问题分析和处理方案常见问题分析和处理方案常规常规PCRPCR步骤中减少第一链产物的量步骤中减少第一链产物的量减少引物的用量减少引物的用量 减少减少PCRPCR的循环次数的循环次数 提高退火温度提高退火温度 提取高质量提取高质量RNARNA，防止被，防止被DNADNA污染污染 1、、DNA提取方法简介提取方法简介2、、DNA提取常见问题、缘由分析及其对策提取常见问题、缘由分析及其对策作业作业3、、RNA提取方法简介提取方法简介4、、RNA提取及其提取及其RT-PCR常见问题、缘由分析及其对策常见问题、缘由分析及其对策 。