试验一 密度梯度离心法提取叶绿体[试验工程]密度梯度离心法提取叶绿体[试验目的]把握手工制作密度梯度技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点[试验原理]不同颗粒之间存在沉降系数差时，在肯定离心力作用下，颗粒各自以肯定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带用不同浓度的蔗糖制成浓度梯度，在离心条件下，叶绿体和比他沉降系数小的细胞组分会聚拢中到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分则沉淀到离心管底部，这样可粗略的分别叶绿体[试验仪器设备]超速冷冻离心机〔BECKMAN L8-60MR〕一台荧光显微镜〔(Olympus，FX-35WA，Japan)〕一台组织捣碎机一台[试验材料]颖菠菜叶片[试验药品]匀浆介质(0.25mol/L 蔗糖，0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液 pH 7.4)；称取 88.55g蔗糖，6.05g Tris，溶解在近 800ml 蒸馏水中，参加约 4.25ml 0.1mol/L HCl， 最终定容至 1000ml60%蔗糖溶液，50%蔗糖溶液，40%蔗糖溶液，20%蔗糖溶液，15%蔗糖溶液[试验内容]1、洗净菠菜叶片，沥干水分，去除叶柄、主脉，称取 50g，剪碎。
2、参加预冷到 0℃的匀浆介质 200ml，用组织捣碎机高档捣碎 2min3、捣碎液双层纱布过滤到烧杯中4、滤液 500r/min 离心 5min，轻取上清液5、在 Polyallomer 离心管内一次参加 50%和 15%蔗糖溶液〔或依次参加 60%，40%，20%，15%蔗糖溶液〕，留意要用滴管吸取 15%蔗糖液沿离心管壁缓缓注入，不能搅动 50%蔗糖液面，一般两种溶液各加 12ml〔四个梯度各加 6ml〕，加液完成后，可见两种溶液接口处折光稍有不同，这样密度梯度便制好了6、在制好的密度梯度上留神的沿着管壁参加 3ml 粗离心过的上清液7、严格平衡离心管，重量缺乏参加少许上清液8、用甩平转头离心〔18000r/min〕90min9、取出离心管，可见叶绿体在密度梯度液中间形成带，用滴管轻轻吸出滴于载玻片，盖上盖玻片，荧光显微镜下观看[试验数据记录及处理]图 1 蔗糖密度梯度离心后叶绿体分别图从离心机中取出离心管，观看到离心管内有一层绿色带，用四种蔗糖浓度制成梯度的管内区带消灭位置比用两种蔗糖浓度制成梯度的管内位置略低于图 2 荧光显微镜检测叶绿体荧光显微镜在 470~490nm 波长的激发光下可看到视野中有大量红色椭圆形物体，应当为叶绿体。
通过蔗糖密度梯度离心可粗略的分别得到叶绿体[试验结论][试验留意事项]1. 细胞裂开时,不必过细，削减裂开叶绿体的产生过滤时不要用力挤压,以避开对叶绿体被膜的裂开2. 制备梯度时,蔗糖颗粒在不同浓度梯度中的集中是不行避开的低温条件下由于溶液的黏度增加,使集中变慢,但同时蔗糖的溶解也会变慢,浓度高时溶解得更加缓慢掩盖时,用宽口枪头吸取,沿管壁轻轻释放制好的梯度假设不马上使用, 则放于冰上,或者放入冰箱内临时存放此外,使用高纯度的蔗糖更加有利于保持梯度的稳定这可能是由于高纯度蔗糖所含杂质离子较少,溶液集中较慢的原因3. 加样时肯定要留神,防止破坏梯度为此,应承受宽口吸头吸取叶绿体粗提物悬浮液,释放时,将枪头贴于管壁接近液面上沿处缓慢释放4. 离心时,为防止速度快速上升和快速下降对浓度梯度层的破坏,离心机的加速肯定要缓慢,而下降时也要缓慢停下此外,为防止高速离心过程中温度上升可能造成的由于颗粒集中而引起的梯度破坏,离心前肯定要让离心机在充分预冷计算好准确离心时间，由于某些型号的离心机在离心起始或到达肯定转速，会有抽真空时间5. 为防止光合作用形成的淀粉颗粒在离心时破坏叶绿体 ,在提取叶绿体前,先将植物材料暗置过夜。
[争论]离心，就是在离心立场的作用下(通常在液态环境中)，不同组分由于迁移率不同，经过肯定的离心时间后，彼此分开，或者直接沉底，便利收集密度梯度离心(density gradient centrifugation)是指待离心的组分在离心力场中迁移时，经过的介质〔也就是离心管中的适合样品分别的缓冲液〕密度不均一，通常是沿着离心力方向线性增大当待离心的组分迁移到和它密度相等的介质层时， 便处于平衡状态，不再迁移最终形成样品层通常，密度梯度离心为了分别金属颗粒物，生物大分子，亚细胞组分等所需的离心机几乎都是超速离心机 密度梯度制作分别活细胞的介质要求：1〕能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2〕PH 中性或易调为中性；3〕浓度大时渗透压不大；4〕对细胞无毒密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖其中氯化绝 CsCl，其密度可达 1.7 g/cm3，用它制成密度梯度可分别核酸、亚细胞器等，也可以分别复合蛋白质(简洁白质不适用)转头的选择：甩平转头是 1951 年由 Kahler(德国)制造得离心转头，适用于低、高、超速离心瘦长离心管用于 R-z 离心可以获得较高纯度和高区分率，且简洁掌握离心时间，壁部入在很少。
25000rpm-30000rpm 的甩平转头最适用于亚细胞器的离心分别，而 40000-42023rpm 的甩平转头适合用于核酸、蛋白、病毒草类物质内流的分别离心时间较长甩平转头用于等密度离心内优缺点分析：甩平转头：用作等密度离心时，壁部效应对分别效果影响较少，梯度变换在甩寻常自然过渡因而很适合做等密度离心试验，优点是回收率高，区分力量强缺点是沉降距离长，最高转速较低〔由于构造层固此类转头最主转速一般在60000rpm 以下〕因而，离心时间很长，对某些长离心管，10-15ml 容量的转头最高转速在 40000-41000rpm，用作自形成 CsCl 梯度的质粒DNA 离心往往需要 50-70小时因此可通过适当提高转速来缩短离心时间在本试验中，1 号管中密度梯度从下到上依次为：60% 50% 40% 15%；2 号管中密度梯度从下到上依次为：60% 15%在 1 号管中离心后样品组织集中在离管底约 1/4 处，所以组织密度约在 1.2296-1.2865g/cm3 之间依据理论，2 号管样品条带应处于液体 1/2 处，但实际条带接近管底，可能是在梯度形成过程中高浓度和底浓度的蔗糖溶液交界处分子自发运动产生的梯度造成的。
因此用密度梯度法分别样品时，可通过密度梯度的合理设置估测样品的密度在荧光显微镜 480nm 激发光下看到视野中消灭大量的红色椭圆形颗粒，即为叶绿体〔如箭白色头所示〕，视野中还有局部较小的不规章红色颗粒，可能是在样品制作过程中捣碎机机械损伤造成的。