酶促反应动力学

第七章 酶促反应动力学概述 研究酶促反应的速率以及影响此速率的各种因素的科学 研究酶结构和功能的关系以及酶的作用机制，需要动力学提供试验数据 发挥酶促反应的高效率，寻找最为有利的反应条件 酶在代谢中的作用和某些药物的作用机制 具有理论研究的意义和实践价值2011-4-1 海洋生命学院 2一、 酶的 活力测定㈠ 酶活力 (enzyme activity)测定1、酶活力与酶反应速度 酶活力指 酶催化一定化学反应的能力 ，以测出的酶促反应速度表示酶的活力 即测定单位时间、单位体积底物减少量或产物增加量来表示 初速度 ，测定产物增加量[ P ]0 X 时 间 TV0VX产物浓度产物浓度变化曲线反应初速度 Vo2、酶的活力单位（ U activity unit) 酶活力单位 （ U）的定义：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物的酶量 国际单位：最适条件下，在 1分钟内催化 1微摩尔底物转化为产物所需的酶量定为 1个单位，即 1IU=1um/min Kcat单位：最适条件每秒钟催化 1摩尔底物转化为产物所需的酶量，定为 1个 Kcat单位 .Kcat单位与 IU单位之间的换算关系如下：1Kcat=60× 106IU1IU=1/60uKcat=16.7nKcat㈠ 酶活力（ enzyme activity)测定BUT……… 限制性核酸内切酶 3种定义 用粘度法测活性： 30℃ ， 1分钟 ， 使底物 DNA溶液的比粘度下降 25%的酶量为 1个酶单位 。

 转化率法： 5分钟使 1ug供体 DNA残留 37%的转化活性所需的酶量为 1个酶单位  凝胶电泳法测活： 37℃ ， 1小时 ， 使 1ugλDNA 完全水解的酶量为 1个酶单位 淀粉酶两种定义A： 1 g可溶性 starch， 在 1h内液化所需的 enzyme量 B： l ml 2%可溶性 starch ， 在 1h内液化所需的enzyme量1g 酶制剂溶于 1000ml H2O， 取 0.5ml与 2%的 starch 20ml反应 ， pH6.0， 10分钟完全液化 ， 求酶活力 A： 20× 2%× 1/0.5× 1000× 60/10=4800u/克 enzyme制剂B： 20/0.5× 1000× 60/10=240000u/克 enzyme制剂3、酶的比活力（ specific activity) 每毫克蛋白质或每毫升蛋白质所含酶的活力单位数，用单位 /毫克蛋白或单位 /毫升来表示， n U/mg或 n U/ml 代表酶的纯度，比活力越大纯度越高 可用来比较每单位质量蛋白质的催化能力，酶产品质量评价中常使用的指标㈠ 酶活力（ enzyme activity)测定4、酶活力的测定方法 测定酶活力就是测定产物的增加或底物的减少，根据产物或底物的物理或化学性质来决定具体酶催反应的测定方法⑴ 分光光度法：利用底物和产物在紫外或可见光部分的光吸收的不同，选择一适当的波长，测定反应中反应进行的情况，酶活力测定中最重要的方法，优点：简便、节省时间和样品㈠ 酶活力（ enzyme activity)测定4、酶活力的测定方法⑵ 荧光法：根据底物或产物的荧光性质的差别来进行测定优点是灵敏度高，缺点是易受其它物质的干扰。

⑶ 同位素测定方法：用放射性同位素的底物，经酶作用所得到的产物，经过适当的分离，测定产物的脉冲数即可以换算出酶的活力单位⑷ 电化学方法：pH测定法，用 pH计测定 pH的变化来测定酶的反应速率㈠ 酶活力（ enzyme activity)测定酶活力测定实例首先 确定反应条件 20℃ 、 pH=7，底物浓度 6g/l（过量），加入 2mg固体脂肪酶第二 确定活力单位 如每小时催化 1克底物 1u= 1g/h第三 测算反应初速度 作产物甘油随时间增加的曲线，量出反应初速度值 ，换算为脂肪的消耗速度 如 8g/h第四 换算活力 8g/h / 1g/h=8u第五 计算比活 8u/2mg酶蛋白 =4u/mg酶蛋白㈡ 、酶活力测定实例脂肪 脂肪酶 甘油 + 脂肪酸 称取 25mg蛋白酶粉配制 成 25毫升酶溶液 ，从中取出 0.1毫升酶液，以 酪蛋白 为底物，用 Folin-酚比色法测定酶活力，得知每小时产生 1500微克酪氨酸 另取 2毫升 酶液，用凯氏定氮法测得蛋白氮为0.2毫克（蛋白质中氮的含量比较固定： 16％） 若以 每分钟产生 l微克酪氨酸 的酶量为 1个活力单位计算 根据以上数据求：（ a） 1毫升酶液中所含蛋白质量及活力单位。

b）比活力 c） 1克酶制剂的总蛋白含量及总活力2011-4-1 海洋生命学院 12二、酶催化的化学动力学 基础㈠ 反应速率及其测定单位时间内反应物的减少量或生成物的增加量表示用瞬时速率表示dtdcv dtdcv dtdcv 2011-4-1 海洋生命学院 13二、酶催化的化学动力学基础㈡ 反应分子数和反应级数⒈反应分子数：反应中真正相互作用的分子数目多为单分子或双分子反应⑴ 单分子反应：单一分子参加反应A→P⑵ 双分子参加反应A+B→P+Qkcdtdcv 21 ckcdtdcv 2011-4-1 海洋生命学院 14二、酶催化的化学动力学基础㈡ 反应分子数和反应级数⒉反应级数：实验测得的表示 反应速率与反应物浓度之间关系 的概念⑴ 一级反应 反应速率与浓度的关系能以单分子反应速率方程式来表示，可以是单、双分子、多分子参加反应 . 水分子参与的双底物的反应由于水分子浓度大，反应的非限制性因素，符合 一级反应kcdtdcv k d tcdc2011-4-1 海洋生命学院 15二、酶催化的化学动力学基础⒉ 反应级数⑵ 二级反应 反应速率与反应物浓度的二次方或浓度乘积成正比关系，可以是双、多分子参加反应 .21 ckcdtdc))(( xbxakdtdx2011-4-1 海洋生命学院 16二、酶催化的化学动力学基础⒉ 反应级数⑶ 零级反应 反应速率与反应物浓度无关而受其他因素影响而改变的反应 .txkktxkdtdxkdtdxkdtdc或或2011-4-1 海洋生命学院 17三、 底物浓度对酶反应速度的影响㈠ 中间络合物学说酶与底物反应时，通过特异识别作用，先形成酶底物复合物， 然后再形成 产物和酶分子，酶分子重新结合底物。

该学说已得到大量实验证实，抗体酶产生；酶反应动力学特征等ES 中间络合物2011-4-1 海洋生命学院 18一个有活性的酶一定含有相应的活性位点同反应的中间过渡状态相匹配ES complex E-transitionstate complex2011-4-1 海洋生命学院 19增加底物浓度21 3 4 5 6 7 800 2 4 6 8底物 (mmole)产物806040200S+E↓P(在一定时间里)2011-4-1 海洋生命学院 20三、 底物浓度对酶反应速度的影响㈠ 中间络合物学说1903年 Henri等以反应速度对底物浓度作图得双曲线[S]：底物浓度， v：反应速度， Vmax：最大反应速度a. 当底物浓度较低时， v与 [S]成正比一级反应b. 随底物浓度增加， v不按正比升高混合级反应c. 再加大底物浓度，零级反应，酶已被饱和2011-4-1 海洋生命学院 211、米氏公式的推导1913年 Michaelis和 Menten根据中间产物学说推导出一个数学表达式，表示了底物浓度与酶反应速度的定量关系通常称为米氏方程如下㈡ 酶促反应的动力学方程式 (单底物 )E+S ES E+PkS  SKSVvs  m a x最大反应速率反应速率底物浓度底物常数2011-4-1 海洋生命学院 22k1k2k3k4E+S ES E+P1、米氏公式的推导1925年 Briggs 和 Haldane提出稳态理论，根据：“稳态平衡”理论反应分二步进行㈡ 酶促反应的动力学方程式 (单底物 )中间复合物形成 产物形成反应系统中 ES的生成速率和ES的分解速率相等时，复合物ES浓度保持不变的这种状态称稳态2011-4-1 海洋生命学院 231、米氏公式的推导㈡ 酶促反应的动力学方程式 (单底物 )132kkkK m  sKSVvm  max EkV 3m a x 米氏方程， Km米氏常数k1k2k3k4E+S ES E+P2011-4-1 海洋生命学院 241、米氏公式的推导⑴ 当 [S]＜＜ Km时，米氏公式为属一级反应动力学，酶未能被底物完全饱和，不适于测定酶活力⑵ 当 [S]＞＞ Km时，米氏公式为⑶当 [S]=Km时，米氏公式为㈡ 酶促反应的动力学方程式 (单底物 )  sKSVvm  m a x   SKvKSVvm 或max   m a xm a x VvSSVv  即     2m a xm a x VSSSVv 零级反应，适于测定酶活力Km为最大反应速度一半时的底物 浓度，单位 mol/L2011-4-1 海洋生命学院 25Michaelis-Menten 方程描述了观察到的速度曲线当 [S] > KmKm 是 V0 = Vmax/2 时的底物浓度2011-4-1 海洋生命学院 262、动力学参数的意义⑴ 米氏常数的意义① Km值是酶的特征常数，只与酶本身性质有关，而与酶浓度无关，每种底物有一个特征的 Km值，且对一定 pH、温度和离子强度而言。

② Km=k2/k1+k3/k1，当 k3＜＜ k2时， Km=k2/k1=Ks， 1/Km值可近似的表示酶对底物亲和力， Km值最小的底物为酶的最适底物或天然底物；否则， Km=Ks+k3/k1， k3/k1为转化比率③ Km值实际用途：若已知某个酶的 Km，就可以算出在某一底物浓度时，其反应速度相当于 Vmax的百分率；计算出任何底物浓度下酶活性部位被底物饱和数 fES=v/vmax=[S]/(Km+[S])㈡ 酶促反应的动力学方程式 (单底物 )132kkkKmE+S ES E+Pk1k2k3k42011-4-1 海洋生命学院 272、动力学参数的意义⑴ 米氏常数的意义④ Km值可以帮助确定某一代谢反应的方向和途径当一系列不同的酶催化连锁反应时，确定各种酶的 Km及相关底物浓度，可有助于寻找限速步骤㈡ 酶促反应的动力学方程式 (单底物 )丙酮酸丙酮酸脱氢酶乳酸 乙酰辅酶 A 乙醛1.7× 10-5mol/L 1.3× 10-3mol/L 1.0× 10-3mol/LA B C D10-2 10-3 10-4当 A、 B、 C浓度接近 10-4时，限速步骤？丙酮酸浓度低时，反应方向？酶工程与代谢工程中改造酶的 Km调控代谢途径（强化则降低 Km，弱化则提升 Km ）2011-4-1 海洋生命学院 282、动力学参数的意义⑵ Vmax和 k3 (kcat)的意义：Vmax对特定的底物也是一个特征常数， pH、温度和离子强度等也影响 Vmaxv=k3[ES]， [S]很大时，酶完全饱和， Vmax=k3[E0] ， k3表示当酶被底物饱和时每秒种每个酶分子转换底物的分子数，叫作转换数，通称催化常数 kcat。

① 当 [S]＞＞ Km，酶被完全饱和， v=kcat[E0]② 当 [S]=Km， v=1/2kcat[E0]③ 当 [S]＜＜ 。