实验八实验八 微生物遗传实验微生物遗传实验----抗药性突变株的分离抗药性突变株的分离 一一 实验目的实验目的n掌握微生物变异的原理掌握微生物变异的原理n了解紫外线诱变筛选突变菌株的方法了解紫外线诱变筛选突变菌株的方法n学习用梯度平板法分离抗药性突变株学习用梯度平板法分离抗药性突变株 二二 实验原理实验原理n基因突变可分为自发突变和诱发突变基因突变可分为自发突变和诱发突变许多物理、化学、生物因素对微生物都许多物理、化学、生物因素对微生物都有诱变作用有诱变作用1、自发突变、自发突变---（抗药性突变）（抗药性突变）1）基因中碱基顺序的改变可导致微生物细）基因中碱基顺序的改变可导致微生物细胞的遗传变异这种变异有时能使细胞胞的遗传变异这种变异有时能使细胞在有害的环境中存活下来，抗药性突变在有害的环境中存活下来，抗药性突变就是一个例子就是一个例子 2 2）微生物的抗药性突变是）微生物的抗药性突变是DNADNA分子的某一分子的某一特定位置的结构改变所致，与药物的存特定位置的结构改变所致，与药物的存在无关，某种药物的存在只是作为分离在无关，某种药物的存在只是作为分离某种抗药性菌株的一种手段，而不是引某种抗药性菌株的一种手段，而不是引发突变的诱导物。
发突变的诱导物3 3）因而在含有一定抑制生长药物浓度的平）因而在含有一定抑制生长药物浓度的平板上涂布大量的细胞群体，极个别抗性板上涂布大量的细胞群体，极个别抗性突变的细胞会在平板上生成菌落突变的细胞会在平板上生成菌落 4 4）将这些菌落挑取纯化，进一步进行抗性试验，）将这些菌落挑取纯化，进一步进行抗性试验，就可以得到所需要的抗药性菌株就可以得到所需要的抗药性菌株5 5）抗药性突变常用作遗传标记，因而掌握分离）抗药性突变常用作遗传标记，因而掌握分离抗药性突变株的方法是非常重要的抗药性突变株的方法是非常重要的6 6）为了便于选择适当的药物浓度，分离抗药性）为了便于选择适当的药物浓度，分离抗药性突变株常用梯度平板法本实验用梯度平板法突变株常用梯度平板法本实验用梯度平板法分离大肠杆菌抗氨苄青霉素突变株分离大肠杆菌抗氨苄青霉素突变株 2 2、紫外线诱发突变、紫外线诱发突变n紫外线是一种常用的物理诱变因素，主紫外线是一种常用的物理诱变因素，主要作用于要作用于DNADNA，引起，引起DNADNA损伤；损伤；n为避免光修复，处理后的微生物应放暗为避免光修复，处理后的微生物应放暗处培养处培养 三三 实验步骤实验步骤 1 1、抗药性菌株的筛选、抗药性菌株的筛选(p.167)(p.167) （（1 1）取一个已经灭菌的空大平皿，把培养）取一个已经灭菌的空大平皿，把培养皿斜放皿斜放( (一边垫起一边垫起) )，在无菌条件下倒入，在无菌条件下倒入不含药物的底层培养基（不含药物的底层培养基（10mL LB10mL LB培养培养基基, ,已分装好，保温在灭菌锅中，要快已分装好，保温在灭菌锅中，要快））；； ( (在超净工作台做在超净工作台做) ) （（2 2）待平板中的培养基凝固后将平皿放平，）待平板中的培养基凝固后将平皿放平，再倒入含有链霉素的上层培养基再倒入含有链霉素的上层培养基10mL10mL（含有链霉素（含有链霉素200u/mL200u/mL：：现配现用，现配现用，原液原液2020万单位，吸万单位，吸5050微升加入微升加入50 ML50 ML培养基）；培养基）；2 2个组做，个组做，8 8个组用。
个组用 ( (在超净工作台做在超净工作台做) ) 在皿底用箭头标记在皿底用箭头标记, ,示药物浓度从低示药物浓度从低到高注意：抗生素要在培养基冷却到注意：抗生素要在培养基冷却到5050度左右度左右再加；再加； n（（3 3）取一支）取一支大肠杆菌液体培养物大肠杆菌液体培养物，用移，用移液枪移取液枪移取200200微升微升菌液到梯度平板上，进菌液到梯度平板上，进行涂布实验室做）行涂布实验室做）n（（4 4）将平板倒置于）将平板倒置于37℃37℃培养培养2 2天天；观察；观察经一次培养的梯度平板上大肠杆菌的生经一次培养的梯度平板上大肠杆菌的生长情况 后续实验（不做）后续实验（不做）n（（5 5）选择平板上）选择平板上1 1～～2 2个生长在梯度平板个生长在梯度平板中部的单个菌落，中部的单个菌落，用无菌接种环接触单用无菌接种环接触单个菌落朝高药物浓度的方向划线个菌落朝高药物浓度的方向划线n（（6 6）将平板倒置于）将平板倒置于37℃37℃培养培养2 2天天；观察；观察经二次培养的梯度平板上大肠杆菌的生经二次培养的梯度平板上大肠杆菌的生长情况 2 2、紫外线诱变枯草杆菌（在实验室做）、紫外线诱变枯草杆菌（在实验室做）1 1）取菌悬液）取菌悬液5ml5ml，放入无菌空平皿（大平皿），，放入无菌空平皿（大平皿），去盖去盖置置于紫外灯下照射于紫外灯下照射3min3min（（15W,15W,距离距离30cm30cm）；）；2 2个组做，个组做，8 8个组用。
个组用2 2）稀释：用）稀释：用1010倍稀释法把经过照射的菌悬液在无菌水中倍稀释法把经过照射的菌悬液在无菌水中（已分装好，每试管（已分装好，每试管9mL9mL）稀释成）稀释成1010-1-1---10---10-6-6同样将未处理的菌液进行同样稀释做对照；未处理的菌液进行同样稀释做对照；3 3）分别取）分别取1010-4-4，，1010-5-5，，1010-6-6稀释菌液稀释菌液150150微升微升各涂一个小各涂一个小平板平板(3(3个对照，个对照，3 3个实验个实验) )；；需用淀粉培养基需用淀粉培养基4 4）培养：）培养： 将上述平板用黑纸包好，置将上述平板用黑纸包好，置37℃37℃培养培养48h48h5 5）观察诱变效应）观察诱变效应 选取菌落较少的平板，加几滴碘液，选取菌落较少的平板，加几滴碘液，观察透明圈大小，同时与对照平板比较观察透明圈大小，同时与对照平板比较 思考题：思考题：1 1、梯度平板中部的单个菌落被划线，并二、梯度平板中部的单个菌落被划线，并二次培养的目的是什么？次培养的目的是什么？2 2、如果要计算紫外线诱变的致死率，该如、如果要计算紫外线诱变的致死率，该如何设计实验？何设计实验？ 。