杜凤移等：三叶鬼针草对蚕豆根尖遗传毒性的研究 949三叶鬼针草对蚕豆根尖遗传毒性的研究杜凤移, 于树华, 马丹炜*, 张苗苗四川师范大学生命科学学院, 四川 成都 610066；四川师范大学细胞生物学研究室，四川 成都 610066摘要：化感作用是外来植物成功入侵和快速扩散的机制之一，为了探讨入侵植物三叶鬼针草（Bidens pilosa L.）的化感作用机制，运用蚕豆根尖微核技术和植物切片技术, 研究了不同质量浓度的三叶鬼针草水浸提液对蚕豆（Vicia faba L.）根尖细胞的遗传损伤和对根生长的影响结果表明，三叶鬼针草水浸提液对蚕豆根尖细胞有丝分裂及生长产生不同程度的抑制和损伤，具有明显的遗传毒性水浸提液对蚕豆根尖的影响存在显著的时间效应和质量浓度效应经切片测量统计，水浸提液促进了成熟区细胞平周分裂，使根尖细胞层数增加；同时显著地抑制了细胞伸长，使根尖缩短，整体表现为使根尖加粗变短三叶鬼针草水浸提液抑制了细胞有丝分裂的正常进行，并随着水浸提液质量分数的升高，分裂期细胞数目下降，微核率逐渐升高。
本研究结果表明三叶鬼针草水溶性化感物质对植物的遗传稳定性及细胞形态结构具有一定的影响，三叶鬼针草的化感作用可能是其成功入侵的机制之一关键词：化感作用；三叶鬼针草；有丝分裂；遗传毒性中图分类号：Q948.12+2.1 文献标识码：A 文章编号：1672-2175（2007）03-0944-04三叶鬼针草(Bidens pilosa L.)为双子叶植物纲菊目菊科鬼针草属(Bidens L.)的一年生草本植物[1]，原产美洲，瘦果冠毛芒状具倒刺，可能附着于人畜和货物带入我国，由于其强烈的入侵性，目前已广泛分布于我国，是重要的旱地杂草外来种入侵生态系统后，不断向环境中释放化感物质，抑制了邻近植物的生长，严重威胁到当地的生物多样性[2]，破坏生态平衡，给经济发展造成巨大的损失，因此入侵植物的化感作用越来越受到人们的重视三叶鬼针草的生物入侵和化感作用虽有一定的研究[3]，但关于三叶鬼针草化感作用对植物细胞有丝分裂和细胞形态影响的研究则未见报道本研究首次采用蚕豆根尖微核技术，研究了三叶鬼针草对蚕豆根尖有丝分裂的影响，并通过切片观察，初步探索三叶鬼针草化感作用(allelopathy)的机理，为深入研究三叶鬼针草化感作用机制提供了理论依据。
1 材料与方法1.1 实验材料 供体植物三叶鬼针草于2006年4月采于四川省成都市龙泉驿区的荒野受体植物成胡14#蚕豆（Vicia faba L.）购于四川省简阳市良种场1.2 研究方法1.2.1 水浸提液的制备 选取发育良好三叶鬼针草植株,洗净风干后粉碎,称取干样150 g, 加入1 L蒸馏水后水浴振荡24 h，将浸提液过0.45 μm微孔滤膜以获得不含微生物的滤液再将滤液在30 ℃旋转蒸发器中减压浓缩,定容至1500 mL，即为制成即得质量浓度为0.1 g·mL-1的原液1.2.2 试验方法按照国家环保总局《水和废水监测分析方法》中“蚕豆根尖微核试验”的方法略有改动[3]选择饱满、大小均匀的蚕豆种子，经w=0.5%次氯酸钠消毒0.5 h后，蒸馏水冲洗数次（3～5次），用蒸馏水在24 ℃恒温下浸种，每12 h换水1次，2 d后选取根尖至2 cm且长势一致的蚕豆放入盛有等量洗净灭菌砂子的培养皿中，每个培养皿20粒，并分别加入0.025 g·mL-1、0.05 g·mL-1、0.075 g·mL-1和0.1 g·mL-1 三叶鬼针草水浸提液40 mL，以蒸馏水作对照每个处理重复3 次。
在24 ℃、80% 湿度、14 h/d光照的条件下继续培养2 d后，每隔24 h从每个处理浓度中抽出20颗蚕豆种子，用蒸馏水浸洗3次，每次3 min，然后移至湿砂中于24 ℃恒温箱中恢复培养24 h后，连续3 d 测定根长1.2.3 植物切片 取各处理组和对照组蚕豆根尖，用FAA固定，参照制石蜡切片，测量成熟区皮层细胞的长和宽[5]1.2.4 根尖细胞染色与制片将蚕豆根尖用卡诺氏固定液(无水乙醇∶冰醋酸= 3∶1, 体积比 ) 固定24 h, 置体积分数为70%的乙醇中于4 ℃冰箱中保存常规制片, 用改良石炭酸品红染液染色压片镜检每个处理观察10个根尖，每个根尖约1 000个细胞，记录分生区细胞总数和分裂期的细胞数以及带有微核的细胞数Nicon E200摄影显微镜拍照有丝分裂指数用根尖中分裂期细胞占根尖细胞总数的百分率表示；微核率用根尖分生区间期细胞出现微核的千分率表示化感效应敏感指数（RI）计算方法参照Williamson[6]等的方法：式中，C为对照值，T为处理值，RI为化感作用效应(RI>0为促进，RI<0为抑制，绝对值的大小与作用强度一致)图1 三叶鬼针草水浸提液对蚕豆根长的影响Fig. 1 The effect of the aqueous extracts of Bidens pilosa L on Vicia faba root length1.3 数据处理采用SPSS13.0软件进行双因素方差分析和Duncan’s多重比较，用Origin7.0绘图。
2 结果与分析2.1 三叶鬼针草对蚕豆根长的影响由图1可见，水浸提液对蚕豆根的生长具有抑制效应，并随着质量浓度的升高和时间的延长呈现出增强的趋势在24 h内各质量浓度处理下，蚕豆根长变化不明显0.025 g·mL-1和0.05 g·mL-1水浸提液对蚕豆根伸长生长有轻微的促进作用，0.075 g·mL-1和0.1 g·mL-1水浸提液略有抑制作用；经过48 h和72 h的处理，各浓度的水浸提液均显著抑制了蚕豆的根长根据观察，在水浸提液作用下，蚕豆根尖出现明显的受害症状：根加粗而呈黄褐色，这种症状随质量浓度升高而加剧，最终导致根变黄甚至变黑说明长时间和高质量浓度水浸提液处理都能致使根尖显著变短2.2 三叶鬼针草对蚕豆根尖成熟区细胞的影响各处理组的蚕豆根尖横切面皮层、中柱鞘细胞都明显小于对照，且细胞排列紧密，径向细胞层数增加，纵切面的细胞纵向长度明显变短(下页图2)在外形上表现为使根尖变短增粗，与“2.1”节的研究结果一致0.025 g·mL-1水浸提液对蚕豆横切细胞的长度和纵切细胞的宽度无显著影响；0.05～0.1 g·mL-1水浸提液对蚕豆横切细胞的长度和纵切细胞的宽度的影响达到显著程度(P<0.05) (表1)，表明三叶鬼针草的水溶性化感物质显著抑制了成熟区细胞的生长。
表1 三叶鬼针草对蚕豆根尖成熟区纵、横切面皮层细胞大小的影响1）Table 1 The effect of Bidens pilosa L. on cell size of vertical and transverse sections of Vicia faba root hair zone水浸提液质量浓度/(g·mL-1)横切纵切长(径向)宽(切向)高(纵向)宽(切向)0.00026.25±1.80a25.11±0.48a47.74±0.58a23.78±0.41a0.02524.70±0.42a23.68±0.49b45.22±0.74b22.93±0.47a0.05021.33±1.04b21.30±1.10c39.35±0.92c18.34±0.76b0.07520.20±1.21bc18.38±0.86d36.82±2.02d16.09±0.38c0.10018.37±0.93c16.27±0.81e31.87±1.67e14.46±0.51d1）表中数据为平均值±标准差 同列数据后缀小写字母不同表示0.05水平上处理间差异显著(P < 0.05) ;下同2.3 三叶鬼针草对蚕豆根尖细胞有丝分裂指数的影响水浸提液对蚕豆根尖细胞有丝分裂指数有显著抑制作用，随浓度的升高和处理时间的延长有丝分裂指数逐渐降低（表2）。
经双因素方差分析，处理浓度和处理时间F值分别为12.12和15.53，均对有丝分裂产生极显著差异经检验处理24 h后，各处理组蚕豆根尖的有丝分裂指数无显著差异处理48 h后，仅0.1 g·mL-1水浸提液对有丝分裂指数的影图2 蚕豆根尖成熟区横切（上）与纵切(下)图(100×)Fig. 2 Transverse (upper) and vertical (down) sections of Vicia faba root hair zoneA: 对照；B: 0.1 mg·L-1水浸提液处理响达到显著程度处理72 h后，随着水浸提液浓度的增高, 蚕豆根尖细胞有丝分裂指数随之降低，与对照组相比，各处理组差异显著说明在处理48～72 h后, 水浸提液的浓度越高, 对蚕豆根尖细胞有丝分裂的抑制作用越强2.4 三叶鬼针草对蚕豆根尖细胞微核率的影响 表2 三叶鬼针草对蚕豆根尖细胞有丝分裂指数的影响（RI）1)Table 2 The effect of the aqueous extracts of Bidens pilosa L. on mitotic index of Vicia faba root tip cells（RI）水浸提液质量浓度/(g·mL-1)有丝分裂指数F值24 h48 h72 h测量值RI测量值RI测量值RI时间质量浓度0.000 6.91a 0.00 7.13a 0.00 6.92a 0.00 15.532)12.122)0.025 6.83a -0.046.40ab-0.115.63b-0.210.050 6.41a -0.116.11ab-0.175.13bc-0.330.075 6.12a -0.165.75ab-0.244.48cd-0.520.100 5.94a -0.195.25b-0.363.55d-0.921) F0.01(2,14)= 6.51, F0.01(4,14)=5.04 ; 2) P<0.01表3 三叶鬼针草水浸提液对蚕豆根尖细胞微核率的影响（RI）1)Table 2 The effect of the aqueous extracts of Bidens pilosa L. on the micronucleus frequency of Vicia faba root tip cells （RI）水浸提液质量浓度/(g·mL-1)24 h48 h72 hF值微核率RI微核率RI微核率RI时间浓度0.000 6.54a 0.00 6.53b0.00 6.59c 0.00 19.762）11.332）0.025 6.33a -0.037.02ab0.078.13c 0.190.050 7.2。