细菌结构基因的鉴定,原理与技术,基因鉴定：对某个基因全方位的研究，包括基因序列测定、基因位置分析和基因编码产物生理功能研究核心是生理功能研究正向遗传学：首先获得突变菌株，接着确定靶基因，同时研究基因功能即从生物的性状、表型到遗传物质来研究基因的功能适用于所有细菌基因功能的研究研究策略,反向遗传学：在获得基因序列的基础上，对靶基因进行必要的改造，得到突变菌株，同时研究基因的功能即从基因到性状、表型来研究基因功能适用于已经完成全基因组测序的细菌研究手段,遗传学、分子生物学、生物化学和细胞生物学等,研究层次与内容,基因、蛋白质和细胞三个层次，体内和体外两个方面内容基因层面：构建表达载体、对其定向突变等蛋白质层面：分离纯化蛋白质、体外分析蛋白质生化特性等细胞层面：构建突变菌株、遗传互补分析等经典模式细菌基因鉴定,主要包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌,通过基因定位鉴定未知基因（以大肠杆菌为例）,基因定位意义,确定发现的基因为新的基因邻近的基因可能为新基因提供一些功能和调节方面的信息基因遗传图位的知识可能为以后的遗传操作提供帮助接合与基因定位,F质粒的特性,,大肠杆菌的致育因子，为100kb质粒,其上主要有转移区、复制区和插入序列三个区域,,根据携带F质粒的情况，大肠杆菌分四种：F－、F＋、F’和Hfr,,Hfr又叫高频重组菌株，是F质粒通过同源重组整合到宿主染色体上，且能随宿主染色体的复制而复制。
在Hfr×F－中，供体菌的染色体可由F质粒的牵引进入受体菌中，且与受体菌染色体同源区域发生重组的效率高，因此得名F质粒通过插入序列IS间的同源重组整合到宿主染色体上可以逆时针插入，也可以顺时针插入，且可以插入染色体多个位置，形成了许多不同的Hfr菌株不同Hfr菌株,中断杂交与染色体图谱,Hfr×F－杂交规律,供体菌染色体在F质粒牵下按 一定方向和均匀速度逐渐进 入F＋细胞DNA转移从F质粒的oriT起 始，F质粒的主要部分在最后 进入受体整个染色体进入受体菌约需用 100分钟，由于在接合过程中 常发生染色体断裂，一般不能 将完整的染色体转移进受体 菌，因此F－菌株不变为F＋中断杂交实验：将接合中的细菌按不同时间取样，并将样品放入搅拌器内猛烈搅拌，以打断细菌的接合管，终止接合由于接合时间不同，不同长度的细菌染色体（基因组）从供体转移到受体，分析受体的基因型即可知细菌染色体的基因转移顺序，以确定细菌染色体上基因位置（包括基因顺序和距离）,Hfr a+b+c+d+e+ Strs×F-a-b-c-d-e-Strr,不同时间取样，分别在含有Str和a、b、c、d、e的基础培养基上进行筛选DNA转移从F质粒的oriT起始，越靠近oriT的基因，越先进入受体 菌。
从上述实验中可知，基因的排列顺序为b—a—e—c—d,不同的Hfr菌株的染色体原点不同，转移方向也不同从不同的Hfr菌株的各个转移基因之间毗邻关系相同但转移起点及方向不同的事实推断出，大肠杆菌的染色体是环状DNA分子利用供体基因进入受体细胞的顺序和时间可绘制出细菌的遗传学图大肠杆菌染色体图谱,图距是时间：分钟,整个染色体为100分钟规定了起始0点，顺时 针方向每个基因占据独立的 时间位置约有1000多个基因被 标定在这一图谱上接合与基因定位,大肠杆菌一突变株：ace， 不能利用乙酸盐为碳源Hfr1×F-(ace)获得原养型接合子1000个通过突变菌株与几个不同Hfr菌株接合，检测原养型接合子的数量定位ace基因Hfr2×F-(ace)获得原养型接合子50个Hfr3×F-(ace)获得原养型接合子1200个Hfr4×F-(ace)获得原养型接合子200个ace在85分钟与5分钟之间转导与基因定位,P1噬菌体,温和性噬菌体，有两种生活方式：溶原和裂解溶原状态以环状质粒形式存在于大肠杆菌细胞内，不与大肠杆菌染色体整合P1噬菌体DNA全长为90kb，约等于大肠杆菌染色两分钟的图距裂解状态以随机包装方式形成成熟颗粒，能将大肠杆菌的染色体随机地包装进噬菌体颗粒中。
转导过程,基因定位,共转导：一种噬菌体同时将两个或多个供体基因转导进入受体菌的现象两个基因在染色体上的位置越近，被共转导的频率就越高在大肠杆菌染色体上相距2分钟之内的基因均有可能被P1噬菌体共转导受体菌：WTD731，对氯离子敏感（cl-），氨卞青霉素抗性(AmR)通过接合，定位在大肠杆菌染色体12′-17′供体菌： ME8975：zbc-3105::Tn10，13′，TcR ME8795：zbd-601::Tn10，15′，TcR ME8451：zbe-280::Tn10，16′，TcR ME8799：zbh-29::Tn10，18′，TcR,杂交结果,ME8795×WTD731 36% ME8451×WTD731 40% ME8975×WTD731 2% ME8799×WTD731 0%,重组率（TcR Cl+）,根据上述结果目的基因位于15 ′ -16 ′,应用实例,构建特殊的大肠杆菌菌株,E.coli MH121 fabA::cat，为油酸的营养缺陷型菌株E.coli YYC1257 cfa::kan，不产生环丙烷十七脂肪酸。
构建E.coli fabA::cat cfa::kan小结,大肠杆菌接合定位确定的基因位置较为粗放，P1转导定位较为准确，更精确定位需使用其它方法基因定位仅确定了基因的位置，DNA序列仍然未知，由此获得的关于基因功能的信息有限但是通过基因定位积累的大肠杆菌突变菌株和相关知识对于现在研究大肠杆菌仍有帮助现代细菌基因鉴定,对于未知序列的基因，采用正向遗传学策略，先确定其DNA序列，然后研究其生理功能对于已知序列的基因，采用反向遗传学策略，构建突变菌株，然后研究其生理功能现代基因鉴定的实质是生理功能的鉴定未知序列的基因主要通过筛选突变菌株获得，已知序列基因是指那些全基因组测序完成的细菌中存在的大量未知功能的基因未知基因的序列鉴定,前提条件,获得了该基因的突变菌株、已知该基因产物的某些功能、有模式细菌的此类基因的研究结果等构建基因文库鉴定未知基因,基因文库：基因文库是指通过克隆方法保存在适当宿主中的一群混合的DNA分子，所有这些分子中的插入片段的总和，可代表某种生物的全部基因组序列或全部mRNA序列，按此可分为基因组文库和cDNA文库细菌一般构建基因组文库细菌基因文库构建,要求,制备100kb以上的基因组DNA。
选择合适的限制性内切酶，部分切割总DNA，回收25-40kb的DNA片段细菌基因文库一般选用cosmid克隆载体柯斯载体（cosmid）：一类人工构建的含有λ噬菌体DNA 的cos序列和质粒复制子的特殊类型的载体复制子一般为ColE1的，携带抗性基因，如AmpR有λ噬菌体的cos序列有多克隆位点（MCS），大小一般为7－10kb，能在大肠杆菌中转化和增殖能携带大小为30－45kb的外源DNA片段体外连接时，外源DNA片段与柯斯载体连接成线性DNA，λ噬菌体头部包装蛋白识别线性DNA上的两个cos位点，进行包装，产生有感染能力的重组噬菌体颗粒，用于感染宿主细胞柯斯载体克隆的策略,体外包装,λ噬菌体在大肠杆菌体内以滚环形式复制，形成多联体线状DNA，其外壳蛋白能识别cos位点，并将两个cos位点间的DNA包装，形成成熟的λ噬菌体研究发现缺失D包装蛋白的λ噬菌体突变株和缺失E 包装蛋白的λ噬菌体突变株，均不能单独包装λ 噬菌体DNA，但将两种突变株分别感染大肠杆菌，从中提取缺失蛋白D的包装物(含E蛋白) 和缺失E蛋白的包装物(含D蛋白)，两者混合后就能包装λ噬菌体DNA目前D包装蛋白和E 包装蛋白已经商品化，可直接用于包装重组DNA，感染宿主大肠杆菌，构建柯斯文库。
注意,完整的基因文库，必须使任何一个基因进入库内的概率均达99 ％换句话说，要求在文库内钓取任何一个基因，均有99 ％的可能性因此需要估算文库至少包含多少个阳性克隆用于计算基因文库应有的克隆数（N值），公式如下： N＝ln(1－P)/ln(1－f/g) 其中，P为从基因文库中选出的任一基因概率，一般定为99％（0.99）；f为载体容量（kb）；g为基因组大小（kb）细菌未知基因的鉴定：遗传互补,以鉴定霍乱弧菌烯脂酰ACP还原酶基因（fabV）为例：,使用福斯载体（fosmid）和专一性宿主（大肠杆菌EPI300）构建基因文库福斯载体（fosmid）：pCC1FOS,具有一般质粒、F因子和λ噬菌体的三重特性携带有F因子单拷贝复制子，可调控的高拷贝复制子和λ噬菌体的cos位点像一般柯斯载体一样可进行体外重组和包装，感染大肠杆菌宿主菌后可像F因子一样以单拷贝存在，在诱导条件下可增加拷贝宿主菌：EPI300,专一性地与pCC1FOS匹配，诱导时能提供高拷贝复制子复制所需的TrfA蛋白EPI300的改造,EPI300为烯脂酰ACP还原酶原养型菌株，不宜直接用于筛选霍乱弧菌烯脂酰ACP还原酶基因大肠杆菌JP1111为烯脂酰ACP还原酶基因（fabI）温度敏感突变菌株，但是不宜直接做为福斯载体的宿主用于基因文库构建。
大肠杆菌fabI位于染色体29分钟处，trpC基因位于28.38分钟处有一菌株CAG18455为trpC::Tn10，四环素抗性以EPI300 fabI(Ts) trpC::Tn10为宿主构建霍乱弧菌的基因组文库，并在42°C筛选可生长的菌株，在经多次亚克隆，得到fabV细菌未知基因的鉴定：酶活性鉴定,遗传互补不仅可以互补大肠杆菌突变菌株，也可以互补其它细菌的相应突变菌株但是在互补其它细菌时使用的柯斯载体上应该携带能够通过接合转移的基因序列，如pLAFR3Massengo-Tiasse, R. P., and J. E. Cronan. 2008. Vibrio cholerae FabV defines a new class of enoyl-acyl carrier protein reductase. J. Biol. Chem.,哈氏弧菌（Vibrio harveyi）中有一种脂酰ACP合成酶，催化脂肪酸直接合成脂酰ACP编码基因未知用EPI300和福斯载体构建哈氏弧菌的基因组文库，将文库菌制备无细胞提取物，并检测Aas活性克隆基因最终获得克隆Jiang, Y., C. H. Chan, and J. E. Cronan. 2006. The soluble acyl-acyl carrier protein synthetase of Vibrio harveyi B392 is a member of the medium chain acyl-CoA synthetase family. Biochemistry.,细菌未知基因的鉴定：Southern杂交,通过一定的技术能获得部分未知基因的序列，如生物信息学能提供该基因的保守序列或者能获得部分蛋白质氨基酸序列等。
根据部分基因序列制备标记杂交探针，通过原位杂交获得阳性克隆，确定未知基因也可以直接用探针与经过适当酶切的总DNA杂交，得到目的片段后再克隆，然后再通过原位杂交获得未知基因构建随机突变菌库鉴定未知基因,用转座子构建细菌随机突变库，从中筛选目的突变菌株通过构建基因文库，遗传互补确定未知基因通过质粒拯救，获取未知基因的部分序列，再通过southern杂交确定基因序列应用细菌蛋白质组鉴定未知基因,蛋白质组(proteome) ：一个细胞在特定生理下表达的所有种类的蛋白质 蛋白质组学(proteomics)：指研究蛋白质组的技术及这些研究所得到的结果，其内容包括蛋。