第四章RNA世界对RNA的传统认识 RNA是真正重要的核苷酸DNA的一种一次性使用的拷贝DNA是我们基因和染色体的原料，决定着我们的遗传特征，而RNA只是DNA指令的一个拷贝，是指导蛋白质合成的信使，在旅行职责后被催化分解 TheNobelPrizeinChemistry1989SidneyAltmanThomasR.Cech1/2oftheprize1/2oftheprizeCanadaandUSAUSAYaleUniversityNewHaven,CT,USAUniversityofColoradoBoulder,CO,USAb.1939b.1947fortheirdiscoveryofcatalyticpropertiesofRNADNA拷贝贝出单链单链 RNA，然后RNA被折叠成复杂杂的形状 RNA的特性2羟基化学性质较DNA活跃，易突变，携带遗传信息能力不如DNA；组成没有蛋白质复杂不如蛋白质结构多样，功能分子作用不如蛋白质；唯一既能携带遗传信息又可为功能分子的生物高分子化合物RNA世界”假说RNA是生命初期最关键的分子，后来当DNA和蛋白质的功能远远超过最初RNA的作用时，它才退到了次要地位。
一、核酶（Ribozyme）的发现发现1982年， Cech等研究四膜虫rRNA时时，发现发现 RNA具有催化功能区别别于传统传统 蛋白酶，Cech给这给这种具有催化活性的RNA定名为为核酶1983年Altman等人在研究细细菌RNaseP时时，发现发现tRNA分子前体的多余序列由RNA切除1.新生RNA的剪接和修饰 mRNA tRNA rRNAmRNA的剪接（mRNAsplicing）hnRNA/pre-mRNA核内的初级mRNA称为杂化核RNA(hetero-nuclearRNA,hnRNA)，或mRNA前体（pre-mRNA）编码区A、B、CABC非编码区断裂基因(splitegene)真核生物结构基因，由若干个编码区（codingregion）和非编码区（non-codingregion）互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因内含子的分类根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为4类：I：主要存在于核、线粒体、叶绿体编码的rRNA、mRNA、tRNA基因；II：真菌、藻类、植物之线粒体和叶绿体mRNA；III：是常见的形成套索结构后剪接（剪接体），大多数mRNA基因有此类内含子；IV：是tRNA基因及其初级转录产物中的内含子，剪接过程需内切酶及ATP。
tRNA前体RNA pol DNAtRNA的转录后加工SplicingRNasePRNaseD内切酶+连接酶rRNA的转录后加工（细菌）（真核细胞）2.Cech小组组的工作四膜虫细细胞中DNA转录转录 成rRNA后，rRNA中一些无意义义的序列，或“内含子”（intron），如何从RNA分子中剪切下来四膜虫：原生动动物，含一种RNA，其组组成中除了核糖体RNA外还还有一个由414个核苷酸组组成的插入序列（interveningsequenc，IVS）发现发现 ：转录产转录产 物rRNA前体不稳稳定，在鸟鸟苷和Mg2+存在下切除自身的413个核苷酸的内含子（IVS），使两个外显显子拼接起来，变变成成熟的rRNA分子无蛋白质质酶参加自我剪接Cech的实验结论 IVS具有类似蛋白酶的功能，能够打断及重建磷酸二脂键 相信rRNA前体能靠自己完成剪接过程在一定条件下rRNA前体可以按一定方式盘绕，进而自己切割自己，以后再把保留rRNA部分的末端连接起来即它是可以催化自由底物的具有酶活性的RNA RNA分子具有自身断裂的催化作用，以及酶活性的另一个重要方面即催化其他分子的反应3. Altman小组组的工作细细菌t-RNA分子的剪接过过程。
发现发现 ：在较较高浓浓度的镁镁离子和适量精氨酸参与下，核酸酶P（ribonucleaseP，RNaseP）中的RNA能够够切割tRNA前体的5端核酸酶P的催化作用是由RNA完成的，而其中的蛋白质质在细细胞内仅仅仅仅 起稳稳定构象的作用二、核酶的作用机制核酶作用的特点：具有催化功能的RNA分子大多通过过催化转转磷酸酯酯和磷酸二酯键酯键 水解反应应参与RNA自身剪切、加工；有些具有RNA连连接酶、磷酸酶等活性底物可以是不同的分子,亦可为为同一RNA分子中的某些部位催化效率较较蛋白质质酶低核酶是一种金属依赖酶金属离子的作用： 特异的结结构作用提供静电电屏障，促进进RNA的总总体折叠，维维持核酶三维结维结 构稳稳定 参与活性部位的化学反应应二价金属离子（Mg2+）与底物活性部位直接相互作用，参与过过渡中间间复合物的形成影响核酶活性的因素 pH值值：pH7.0-7.5核酶活性最高 二价金属阳离子（Mg2+Mn2+）对对活性的影响 抗生素对对活性的影响：大多数为为抑制效应应 变变性剂对剂对 活性的影响 温度对对活性的影响：65范围围内随温度升高而增加，37时时均有适宜的活性 不需要能量和蛋白因子剪切型核酶剪接型核酶根据催化反应锤头核酶I内含子II内含子发夹核酶丁型肝炎病毒（HDV)核酶RNase P核酶的分类1.锤头锤头 （Hammerhead)结结构核酶从类病毒中分离出来的一类较小的核酶从类病毒中分离出来的一类较小的核酶底物部分通常为60个核苷酸左右同一分子上包括有催化部份和底物部份催化部份和底物部份组成锤头结构 三个双螺旋区 13个核苷酸残基保守序列 剪切反应应在右上方GUX序列的3端自动发动发 生 催化过过程需要二价金属离子参与。
结构特点作用机制单金属离子催化双金属离子催化作用底物锤头结锤头结 构的主要类类型R：酶；S：底物，箭头头：剪切位点17位（X）的核苷酸残基多数是C，不能是G.7位核苷酸残基的置换不会对酶活性产生很大影响两个特殊位点177人工设计的核酶粗线线表示合成的核酸分子细线细线 表示天然的核酸分子X表示共有序列箭头头表示切断点特点 催化结构域小，既可作为转基因表达产物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运 免疫源性低，很少引起免疫反应 通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强应用 基础研究 防治动、植物病毒侵害：马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶构建，马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变核酶的克隆，烟草花叶病毒核酶等 基因治疗：肿瘤，乙肝，HIV等3.发夹发夹 （hairpin）结结构核酶 存在于三种植物RNA病毒（烟草环环点病毒，菊苣黄色斑点病毒型和筷子芥花叶病毒）中 金属离子在催化反应应中起结结构作用，剪切活性比锤头结锤头结 构核酶高 发夹二级结构模型二级结构5环环和4螺旋形成两个结结构域剪切反应发应发 生在底物识别识别 序列GUC的5端两个内部环环中的碱基及在螺旋区的G11和底物中的G+1都是酶发挥发挥作用所必需的。
4.HDV核酶HDV可重复感染乙肝病毒（HBV)感染的RNA病毒，可加重HBV感染症状，导导致肝硬化1.7kb组组成的缺陷型负链负链 RNA病毒，呈环环状感染细细胞后，通过滚环过滚环 机制进进行的RNA指导导的RNA复制，由核酶将长长的转录转录 物剪切成单单位长长度的RNA病毒核心需要乙肝病毒(HBV)的HBsAg进进行包装，才能形成具有感染活性的成熟病毒颗颗粒所以HDV总总是伴随HBV感染，否则则HDV的感染就是一个自限性的过过程而不能形成慢性感染HDV核酶斧头结头结 构模式 三个碱基对对的茎；需要二价阳离子；产产生5-OH和2,3-环环磷酸剪切部位剪切部位5.核糖核酸酶P（RNaseP） 组成：单链RNA分子,长度为375个碱基；相对分子质量为20kDa的多肽(119个氨基酸残基) 功能：RNA具有催化切割tRNA的能力,蛋白质则起间接的作用,可能是维持RNA结构的稳定 定位：广泛存在于原核生物和真核生物（核仁、叶绿体和线粒体）中 也参与核糖体RNA的加工 大肠肠杆菌RNaseP具有两个组组分：一条RNA链链（M1-RNA）和一个蛋白质质（C5蛋白） 胞内两组组分对对于功能的发挥发挥 都是必要的；体外M1-RNA可以独自发挥发挥 催化的功能。
C5蛋白主要是增强底物结结合的亲亲和力 真核生物RNaseP的RNA链链与细细菌中所发现发现 的结结构相似，但独立的RNA无催化活性细菌与真核生物RNaseP zh.wikipedia.org/zh-cn/File:RNase_P.pngP结合底物tRNA的晶体结构 tRNA枯草芽孢杆菌E.coliRNaseP中RNA的二级级结结构RNaseP识别识别 底物的高级结级结 构RNaseP底物的二级结级结 构6.I6.I类类类类内含子的剪接内含子的剪接 型自我剪接内含子线粒体基因组组中发现发现 ，也存在于极少数单细单细 胞真核生物(如嗜热热四55膜虫的rRNA)的核基因组组中原核体系中少数内含子也是型内含子（如T4噬菌体胸苷酸合成酶基因） 内含子切割位点的内含子切割位点的2 2个特点个特点 内含子两末端不存在同源或互补补序列在剪切的初始阶阶段，可能直接连连接； 连连接点具有很短的保守序列为边为边 界顺顺序 100种内含子的5端都是GT；3端都是AG，因此称为为GT-AG法则则（GT-AGrule），又称为为Chambon法则则类内含子的结构特点 边边界序列为为5UG3I I类类类类内含子剪接机制内含子剪接机制 I类类内含子剪接的机制是二次转酯转酯 反应应： 细细胞中游离GTP上的3-OH对对内含子5和外显显子交界处处的U-A之间间的磷酸二酯键发酯键发 起亲亲核进进攻，切开外显显子，而其3-OH和内含子5端（A）的磷酸形成了新的磷酸二酯键酯键 ，从而结结合到内含子上，这这是第一次转酯转酯 反应应。
切下外显显子的3端（U）的-OH基又对对内含子3端交界的磷酸二酯键酯键 作亲亲核进进攻，切下内含子，而和外显显子2以新的磷酸二酯键酯键 相联联pG-OH(ppG-OH,pppG-OH)U-OHGpUpGpA第一次转酯反应第二次转酯反应UpAGpU外显子1内含子外显子2G-OHUpUpGpACech用四膜虫为为材料来研究真核生物染色体的结结构对对基因表达的影响 四膜虫rRNA前体的自我剪接剪接机制I类内含子的酶学特性四膜虫L-19IVS的体外催化活性Interveningsequencelacking19nucleotide缺少19个核苷酸的居间序列1986年女科学家Grabowski,P.J.发现L-19可以催化5聚胞苷（5XpC）聚合为多聚胞苷 内导顺序L-19IVS催化RNA寡核苷酸链延长7. II类类内含子剪接 边边界序列GTAG外；分支位点5GUGCGYnA 剪接无需鸟鸟苷的辅辅助，需镁镁离子的存在 分支点A的2-OH对对5端外显显子和内含子交界处处的磷酸二酯键发动亲酯键发动亲 核进进攻切下外显显子1，内含子5的边边界序列上的G与5磷酸和分支点A的2-OH形成磷酸二酯键酯键 ，从而产产生了套索（lariat）结结构； 切下的外显显子1的3-OH继续对继续对 内含子3端的交界序列进进行亲亲核进进攻，切下的外显显子2的5磷酸和外显显子1的3-OH形成磷酸二酯键酯键 ，连连接在一起，同时释时释 放出套索状的内含子。
II类内含子剪接机制三、RNA机器制造蛋白质 核糖体能解码一个无限数量的不同mRNA 核糖体是一种非比寻常的催化剂 原子水平的核糖体结构图RNA分子发生复杂的折叠，但是有大量的蛋白质支持核糖体就是一个核酶，一个RNA催化剂核糖体大亚基蛋白质合成活性部位蛋白质RNA四、microRNA（miRNA） 内生的、长长度约约20-24个核苷酸的小RNA, 发夹结发夹结 构的约约70-90个碱基大小的单链单链 RNA前体经过经过 Dicer酶加工后生成 在细细胞内具有多种重要的调节调节 作用每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节调节同一个基。