多所发生地方多所发生地方 引引 言言 基因克隆的本质基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到是使目的基因在特定的条件下得到扩扩增和表达增和表达，而目的基因本身无法进行复制和表达、，而目的基因本身无法进行复制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于借助于“载体载体”及其及其“寄主细胞寄主细胞”来实现作为基因克隆的载体必须具备以下特性：作为基因克隆的载体必须具备以下特性：⑴⑴载体必须是复制子载体必须是复制子⑵⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选⑶⑶具备多克隆位点（具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入便于外源基因插入⑷⑷自身分子量较小，拷贝数高自身分子量较小，拷贝数高⑸⑸在宿主细胞内稳定性高在宿主细胞内稳定性高 （一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性（（7））质粒的存在形式质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种，线状双螺旋三种，双螺旋共价闭合双螺旋共价闭合环（环（SC构型）构型）开环双螺旋开环双螺旋（（OC构型）构型）线状双螺旋线状双螺旋（（L构型）构型） （二）质粒DNA的制备 有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。
目前一般使用碱变性法制备质粒DNA这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA 碱变性法质粒提取的原理：碱变性法质粒提取的原理： 根据共价闭合环状质粒根据共价闭合环状质粒DNADNA与线性染色体与线性染色体DNADNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的 在在pHpH值值12.012.0～～12.512.5范围内时，线性的范围内时，线性的DNADNA会被变性而共价闭合环状质粒会被变性而共价闭合环状质粒DNADNA却却不会被变不会被变性 通过冷却或恢复中性通过冷却或恢复中性pHpH值使之复性，线性值使之复性，线性染色体形成网状结构，而染色体形成网状结构，而cccDNAcccDNA可以准确迅速可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNAcccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNADNA 碱变性法提取质粒的步骤：碱变性法提取质粒的步骤：1 1、取、取1.51.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀；微量离心管中，离心收集细胞沉淀；2 2、加入、加入100100微升冰冷的溶微升冰冷的溶液液I I，（，（50mM50mM葡萄糖，葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA）涡旋震荡）涡旋震荡悬浮菌液。
悬浮菌液3 3、加入、加入200200微升新配制的溶液微升新配制的溶液IIII，（，（0.2M NaOH0.2M NaOH，，1.0%SDS1.0%SDS））缓缓缓缓混匀置室温混匀置室温5 5分钟4 4、加入、加入150150毫升冰冷的溶液毫升冰冷的溶液IIIIII，（醋酸钾，（醋酸钾29.429.4克，克，冰乙酸冰乙酸11.511.5毫升，加蒸馏水至毫升，加蒸馏水至100100毫升）颠倒离毫升）颠倒离心管心管1010次后，冰浴次后，冰浴5 5分钟5 5、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒集质粒DNADNA （三）质粒载体的改造（三）质粒载体的改造⑴⑴去掉不必要的去掉不必要的DNADNA区段⑵⑵减减少少限限制制酶酶的的识识别别位位点点，，一一种种酶酶只只保保留留一一个个单一的限制性酶切位点）单一的限制性酶切位点）⑶⑶加入易于捡出的选择性标记基因加入易于捡出的选择性标记基因⑷⑷对对质质粒粒进进行行安安全全性性改改造造，，要要求求质质粒粒不不能能随随便便 转移⑸⑸改造或增加基因表达的调控序列改造或增加基因表达的调控序列 1 1、质粒、质粒pBR322 pBR3224363结构：结构：（（1 1）氨苄青霉素抗性基因（）氨苄青霉素抗性基因（ampampr r或或ApApr r）） 3 3种限制酶单一识别位点种限制酶单一识别位点 。
2 2）四环素抗性基因（）四环素抗性基因（tetr或或Tcr））内部有内部有7 7种，启动区内有种，启动区内有2 2种限制种限制酶单一识别位点酶单一识别位点 3））DNA复制起点（复制起点（ori）） pBR322质粒的优点：质粒的优点：（（1 1）具有较小的分子量具有较小的分子量 4363bp 4363bp，，2.62.6××10106 6DaDa，，（（2 2）具有两种抗菌素抗性）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记基因可供作转化子的选择记号 （（3 3）具较高的拷贝数，而）具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后且经过氯霉素扩增之后, ,每每个细胞中可累积个细胞中可累积10001000～～30003000个拷贝4 4）对多种常见的限制性）对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切内切核酸酶只含有一个能切割的位点割的位点 pBR3224363 外源外源DNApBR3224363PstI酶切酶切PstI酶切酶切黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端连接酶连接酶重组子重组子(ampstetr) 空载体空载体(amprtetr) 插入子插入子(ampstets) 野生型的野生型的E.coli (ampstets) 导导入入涂布在含涂布在含Tc的平板上的平板上重组子转化子重组子转化子(ampstetr) 空载体空载体转化子转化子(amprtetr)影印在含影印在含Ap的平板上的平板上空载体空载体转化子转化子(amprtetr)因插入外源因插入外源DNA而导致基因失活的现象称之为插入失活效应而导致基因失活的现象称之为插入失活效应对比两个平板上的菌落，凡在对比两个平板上的菌落，凡在Tc平板上生长而在平板上生长而在Ap平板上不能生长的菌落则是平板上不能生长的菌落则是重组质粒转化子克隆，挑选阳性克隆，分离出重组质粒。
重组质粒转化子克隆，挑选阳性克隆，分离出重组质粒 2、、pUC质粒载体质粒载体1987年，年，J.Messing和和J.Vieria采采用用MCS技术在技术在pBR322基础上构基础上构建的建的结构：结构：（（1）来自于）来自于pBR322的的Ori（（2）氨苄青霉素的抗性基因）氨苄青霉素的抗性基因(ampr) 但核苷酸序列发生了变化但核苷酸序列发生了变化（（3）） LacZ′基因基因 编码编码β—半乳糖酶的半乳糖酶的α—肽链即氨基末肽链即氨基末端4））MCS区段区段是一段用于插入外源是一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点在整连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点在整个载体中是唯一的个载体中是唯一的 2、、pUC质粒载体质粒载体与与pBR322相比，相比， pUC质粒载体优点：质粒载体优点：（（1）具有更小的分子量和更高的拷贝数）具有更小的分子量和更高的拷贝数 如如pUC8为为2 750bp，，pUCl8为为2 686bp，，控制质粒复制控制质粒复制rop基因的缺失，平均每个细胞即可达基因的缺失，平均每个细胞即可达500～～700个拷贝个拷贝（（2）适用于组织化学法检测重组体）适用于组织化学法检测重组体通过通过 -互补互补作用，利用菌落颜色筛选重组子作用，利用菌落颜色筛选重组子。
3）具有多克隆位点区段（）具有多克隆位点区段（MCS））可以定向克隆防止载体自我连接可以定向克隆防止载体自我连接 -互补互补 (alpha-complementation) 大大肠肠杆杆菌菌 -半半乳乳糖糖苷苷酶酶 可可以以和和其其底底物物X-Gal 相相互互作作用用并并且且释释放放出出一一种种蓝蓝色色物物质质，，当当该该酶酶的的 -片片段段和和 -片片段段分分开开时时就就失失去去了了这这种种显显色色的的功功能能通通常常将将编编码码该该酶酶 -片片段段的的LacZ’ 基基因因插插入入到到载载体体的的多多克克隆隆位位点点的的侧侧翼翼序序列列中中，，而而在在一一些些人人工工构构建建的的大大肠肠杆杆菌菌株株系系中中却却只只能能编编码码产产生生该该酶酶的的 片片段段这这样样一一来来，，含含有有功功能能性性完完整整的的LacZ’ 基基因因的的载载体体导导入入到到这这类类寄寄主主细细胞胞中中时时，，载载体体编编码码的的 -片片段段就就能能和和寄寄主主编编码码的的 片片段段发发生生互互补补并并具具有有了了对对底底物物X-gal的的作作用用功功能能（（发发生生显显色色反反应应）），，这这种种现现象象被成为是被成为是 alpha-complementation.X-Gal：：5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-β-D-半乳糖苷半乳糖苷 释释放放出出的的蓝蓝色色物物质质可可以以将将整整个个菌菌落落染染成成蓝蓝色色，，非非常常容容易易辨辨别别，，如如果果 LacZ’插插入入外外源源基基因因被被破破坏，菌落则是无色的坏，菌落则是无色的 。
组织化学法检测重组体组织化学法检测重组体X-Gal -半乳糖苷酶半乳糖苷酶IPTG诱导物诱导物异丙基异丙基-β-D-硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷 半乳糖半乳糖 5-溴溴-4-氯氯-靛蓝靛蓝＋ 二、二、 噬菌体载体噬菌体载体（（phage vectors））（（一）一） 噬菌体载体噬菌体载体（（二）二） M13噬菌体载体噬菌体载体（三）柯斯质粒载体（三）柯斯质粒载体 1. 噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性溶菌周期溶菌周期指噬菌体将指噬菌体将DNADNA注入寄主细胞后很快环化，然后注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体溶源周期溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体中，注入寄主细胞的噬菌体DNADNA是整合到寄主细是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为溶源性细溶源性细菌菌在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体。
在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNADNA被被称为称为原噬菌体原噬菌体噬菌体噬菌体温和噬菌体，具有溶源生长周期和溶菌生长周期温和噬菌体，具有溶源生长周期和溶菌生长周期烈性噬菌体烈性噬菌体, ,只具有溶菌生长周期只具有溶菌生长周期 1. 噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性 2. 噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性 2. 噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性 ⑴⑴组成：组成：蛋白质外壳和蛋白质外壳和线状双链线状双链DNADNA分子组成分子组成 DNA长长度度为为48502bp48502bp，，在在分分子子两两端端各各有有1212个个碱碱基基的的单单链链互互补补粘粘性性末末端端当当其其注注入入到到寄寄主主细细胞胞中中后后，，可可以以迅迅速速通通过过这这两两个个粘粘性性末末端端的的互互补补作作用用形形成成双双链链的的环环形形DNADNA分分子子上上述述通通过过粘粘性性末末端端互互补补形形成成的的双双链链区区被被称称为为coscos位位点点（（cohesive end sitecohesive end site））. .GGGCGGCGACCT 2. 噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性⑵⑵是一个温和噬菌体是一个温和噬菌体一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长周期。
一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长周期⑶⑶复制复制溶源周期随溶源细菌染色体一起复制溶源周期随溶源细菌染色体一起复制溶菌周期的早期是溶菌周期的早期是“θ”“θ”复制，晚期进行滚环复制复制，晚期进行滚环复制⑷⑷基因组成基因组成 DNADNA至少包括至少包括6161个基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中个基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约1 1／／3 3为非必须为非必须区段 λ噬菌体载噬菌体载体类型体类型置换型置换型 （（Replacement vectors））这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之间的在两个位点之间的λDNA区段是区段是λ噬菌体噬菌体的非必需序列，可以被外源插入的的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代如如Charon 4 载体克隆能力大，克隆能力大，20～～25kb插入型插入型 （Insertion vectors ））这种载体仅仅有一个可供外源这种载体仅仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点插入的克隆位点如：如：λgt10 、、 λgt11 克隆能力小，不到克隆能力小，不到10kb 噬菌体载体的噬菌体载体的类型类型 ①① Insertion vectors ②②Replacement vectors 置换型载体 （二）（二）M13噬菌体噬菌体 1 1、丝状噬菌体、丝状噬菌体M13噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性⑴⑴是单链闭合环状噬菌体是单链闭合环状噬菌体只只能能感感染染雄雄性性细细菌菌，，外外形形成成丝丝状状，，基基因因组组DNA长长约约6.4kb，，可可分分为为10个个区区和和507 bp基基因因间间隔隔区区（（IS区区）），，该该区区可可以以接接受受外外源源DNADNA的的插插入入而而不不会会影影响响到到噬噬菌菌体体的的活活力。
这是该噬菌体能用于单链力这是该噬菌体能用于单链DNADNA载体的重要前提载体的重要前提⑵⑵复制与增殖（图）复制与增殖（图） M13噬菌体的复制与增殖噬菌体的复制与增殖“＋＋”DNACPCP脱落，脱落，“＋＋”DNA复制复制RF－－DNA“θ”型复制型复制积累积累200～～300份份滚环复制滚环复制＋＋SSB外溢时被包装外溢时被包装M13噬菌体噬菌体 2. M13噬菌体载体的构建噬菌体载体的构建这类载体的这类载体的突出优点突出优点在于其既在于其既可以提供单链可以提供单链DNADNA，也可以提，也可以提供双链的供双链的DNADNA其最大的不足最大的不足在于在于插入大的插入大的DNADNA片段片段后表现后表现不稳定，在噬菌体增殖过程不稳定，在噬菌体增殖过程中容易发生缺失所以中容易发生缺失所以一般一般克隆的片段在克隆的片段在1kb1kb之内之内，克，克隆隆300-400bp300-400bp的片段十分稳的片段十分稳定 ⑴ ⑴ 在在ISIS区内插入区内插入LacLacZ Z基因基因 ⑵ ⑵在标记基因区内组装在标记基因区内组装MCSMCS区段区段所以能通过所以能通过 互补在互补在X-Gal/ IPTGX-Gal/ IPTG平板上平板上识别重组体。
这类载体包识别重组体这类载体包括了括了 M13mp8 M13mp8、、9 9 和和 M13mp18 M13mp18 、、 19 19等 （三）柯斯质粒载体（（三）柯斯质粒载体（cosmid vectors））柯斯质粒载体的特点柯斯质粒载体的特点 柯斯质粒是一类人工构建的含有柯斯质粒是一类人工构建的含有 DNA的的cos序列序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，cosmid是是cos site carrying plasmid的缩写柯斯质粒的大小为柯斯质粒的大小为4-6kb，，由由3部分组成：部分组成： A.多克隆位点区多克隆位点区 B. 含有含有cos位点的位点的 DNA区区 C. 复制起始位点和抗性标记区复制起始位点和抗性标记区pHC79OriMarkerMCScos DNA （三）（三） 柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（cosmid vectors））柯斯质粒载体的特性柯斯质粒载体的特性1 1、具有、具有 噬菌体的特性噬菌体的特性 柯斯质粒连接上适宜长度的外柯斯质粒连接上适宜长度的外源源DNADNA后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主细胞。
进入寄主细胞的细胞进入寄主细胞的DNADNA也能环化和复制，但是不会形成也能环化和复制，但是不会形成新的噬菌体颗粒，也不能发生溶菌现象新的噬菌体颗粒，也不能发生溶菌现象2 2、具有质粒载体的特性、具有质粒载体的特性 能象质粒一样在寄主细胞内复能象质粒一样在寄主细胞内复制，且带有抗性选择标记基因，有些还带有插入失活型的多制，且带有抗性选择标记基因，有些还带有插入失活型的多克隆位点，为重组体的筛选提供了方便克隆位点，为重组体的筛选提供了方便3 3、高容量的克隆能力、高容量的克隆能力 coscos质粒本身很小，只有复制起质粒本身很小，只有复制起点、选择标记和点、选择标记和coscos位点等构成，所以其克隆上限可达位点等构成，所以其克隆上限可达45kb45kb左右不过由于包装的限制，其克隆片段至少要达到左右不过由于包装的限制，其克隆片段至少要达到30kb30kb （三）（三） 柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（cosmid vectors））柯斯质粒载体的应用柯斯质粒载体的应用 噬菌体的位点特异切割体系噬菌体的位点特异切割体系——末端酶（末端酶（terminase）体系，识别两个相）体系，识别两个相距距38-54kb cos位点，并进行切割，后被包装。
位点，并进行切割，后被包装 下面的操作中缺点是：下面的操作中缺点是：cosmid自我重组、外源自我重组、外源DNA片段串联片段串联 后重组OriMarkerMCScos DNA 质粒质粒λ噬菌体噬菌体柯斯质粒柯斯质粒单链噬菌体单链噬菌体克隆克隆DNA大片段大片段±*++-构建基因组文库构建基因组文库-++-构建构建DNA文库文库+---常规的亚克隆化常规的亚克隆化+---构建新型的构建新型的DNA结构结构+---序列分析序列分析+--+单链探针单链探针+**--+外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达+---四种常用载体的比较* * 外源外源DNADNA如超过如超过10kb10kb，则重组质粒的转化率和，则重组质粒的转化率和DNADNA得率都非常低得率都非常低 ** ** 已有个别材料可用于此目的 已有个别材料可用于此目的 第二节第二节 基因操作的工具酶基因操作的工具酶一、一、 限制性核酸内切酶及其应用限制性核酸内切酶及其应用二、二、 DNA连接酶及其应用连接酶及其应用三、三、 DNA聚合酶及其应用聚合酶及其应用四、四、 修饰性工具酶修饰性工具酶 （（一）限制性核酸内切酶的发现一）限制性核酸内切酶的发现（（二）限制性核酸内切酶的分类二）限制性核酸内切酶的分类（（三）限制性核酸内切酶的命名三）限制性核酸内切酶的命名（（四）四） II型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性（（五）限制性核酸内切酶的消化反应五）限制性核酸内切酶的消化反应一、一、 限制性核酸内切酶及其应用限制性核酸内切酶及其应用 由寄主控制的由寄主控制的限制限制和和修饰修饰现象现象---20世纪世纪60年代，年代，Linn和和Arber 发现发现 (B) (K)大肠杆菌大肠杆菌B大肠杆菌大肠杆菌K114×10 — 410 — 4E.O.P 成斑率成斑率efficiency of plating外源外源DNA自身自身DNA（一）核酸限制性核酸内切酶的发现（一）核酸限制性核酸内切酶的发现：：切酶切酶。
E.E.colicoliB B含有含有EcoBEcoB核酸酶和核酸酶和EcoBEcoB甲基化酶甲基化酶 当当λ(k)λ(k)噬菌体侵染噬菌体侵染E.E.colicoliB B时，时，由于其由于其DNADNA中有中有EcoBEcoB核酸酶特异识别的碱核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉而基序列，被降解掉而E.E.colicoliB B的的DNADNA中中虽然也存在这种特异序列，但可在虽然也存在这种特异序列，但可在EcoBEcoB甲基化酶的作用下，催化甲基化酶的作用下，催化S-S-腺苷甲硫氨腺苷甲硫氨酸（酸（SAMSAM）将甲基转移给限制酶识别序列）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化的特定碱基，使之甲基化 EcoB EcoB核酸酶核酸酶不能识别已甲基化的序列不能识别已甲基化的序列 限制限制—修饰的酶学系统修饰的酶学系统 (B) (B)酶切位点酶切位点不被修饰不被修饰噬菌体噬菌体DNA被切割被切割酶切位点酶切位点被修饰被修饰基因组基因组DNA不被切割不被切割 §最早分离出的限制内切酶最早分离出的限制内切酶——1968年，年，Meselson和和Yuan，，大肠杆菌大肠杆菌B和和K菌株，菌株，EcoB和和EcoK，， 是是I型的，没有实用价值。
型的，没有实用价值§首个首个II型限制内切酶型限制内切酶——1970年，年，H.O.Smith等从等从Heamophilus influenzae的的Rd菌株中菌株中Hind II 使使得得DNADNA分子的体外精确切割成为可能分子的体外精确切割成为可能§从此，相关研究展开如从此，相关研究展开如NEB公司的提取和克公司的提取和克隆目前已纯化出已纯化出3000种限制性内切酶中种限制性内切酶中，，其其中有中有30%是在是在NEB发现的发现的 §限制性核酸内切酶（限制性核酸内切酶（restriction restriction endonucleaseendonuclease ）：）：是一类能够识别双链是一类能够识别双链DNADNA分分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNADNA双双链结构的核酸内切酶切开的是链结构的核酸内切酶切开的是3 3，，5 5－磷酸二－磷酸二酯键 （二）限制性核酸内切酶的类型及其主要特性（二）限制性核酸内切酶的类型及其主要特性 特性特性1. 限制修饰活性限制修饰活性2. 内切酶的蛋白内切酶的蛋白 质结构质结构3. 限制辅助因子限制辅助因子4. 切割位点切割位点5. 特异性切割特异性切割6. 基因克隆中基因克隆中 I 型型双功能的酶双功能的酶3种不同亚基种不同亚基ATP、、Mg2+和和S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸距特异性位点距特异性位点5‘端至少端至少1000bp不是（随机）不是（随机）无用无用 II 型型限制酶和修饰酶分开限制酶和修饰酶分开单一成分单一成分 Mg2+位于识别位点上位于识别位点上 是是非常有用非常有用 III 型型双功能酶双功能酶2种亚基种亚基ATP、、Mg2+和和S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸特异性位点特异性位点3‘端端24-26bp处处是是用处不大用处不大 （三）限制性核酸内切酶的命名（三）限制性核酸内切酶的命名1、、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体个斜体 字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichia coli 表示为表示为Eco , 流感嗜血菌流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示为表示为 Hin；；2、、用一个正体字母表示菌株的类型，比如用一个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、、Hind；；3、、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则 用罗马数字标出，比如用罗马数字标出，比如Eco R I、、 Hind III。
（四）（四）IIII型限制性核酸内切酶的基本特点型限制性核酸内切酶的基本特点1、识别位点的特异性、识别位点的特异性 每种酶都有其特定的每种酶都有其特定的DNA识别识别 位点，通常是由位点，通常是由4～～8个核苷酸组成的特定序列（靶个核苷酸组成的特定序列（靶序列）2、识别序列的对称性、识别序列的对称性 靶序列通常具有双重旋转对称靶序列通常具有双重旋转对称 的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构3、切割位点的规范性、切割位点的规范性 交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子） 几种几种IIII型限制性核酸内切酶的酶切位点型限制性核酸内切酶的酶切位点Pst IProvindencia stuartii 164 CTGCAGGACGTCHaemophilus influenzae Rd 与与II型核酸内切酶有关的几个概念型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端粘性末端 cohesive ends是指是指DNA分子在限制酶的作用之下形成分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。
的配对而重新环化起来平平 末末 端端 Blunt end Blunt end在识别序列对称处同时切开在识别序列对称处同时切开DNADNA分子两条链，分子两条链，产生的平齐末端结构则不易于重新环化产生的平齐末端结构则不易于重新环化 同裂酶同裂酶 isoschizomers isoschizomers 能识别和切割同样的核苷酸靶序列的能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同来源的内切酶不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别不同来源的内切酶不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别同尾酶同尾酶 isocaudamers isocaudamers 识别的靶序列不同，但能产生相同粘识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶如性末端的一类限制性核酸内切酶如BamH I 、、BclI、、BglII和和Xho I 是一组同尾酶是一组同尾酶注注 意：意： 由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。
该两种酶的任一种所识别 平齐末端带带5’－－P端的黏性末端端的黏性末端带带3’－－OH 和和5’－－P端的平末端端的平末端例如例如HpaⅡⅡ和和MspⅠⅠ是同裂酶，识别顺序都是是同裂酶，识别顺序都是 5’……C|CG G……3’ 3’……G GC|C……5’ 如果其中有如果其中有5’-甲基胞嘧啶，甲基胞嘧啶，HpaⅡⅡ不能够切割，不能够切割，MspI能切割 经同尾酶消化的经同尾酶消化的DNADNA末端连接示意图末端连接示意图5’ XXXXGGATCCXXXXXX 3’3’ XXXXCCTAGGXXXXXX 5’BamH I5’ XXXXG GATCCXXXXXX 3’ 3’ XXXXCCTAG GXXXXXX 5’5’ XXXXAGATCTXXXXXX 3’3’ XXXXTCTAGAXXXXXX 5’Bgl II5’ XXXXA GATCTXXXXXX 3’ 3’ XXXXTCTAG AXXXXXX 5’5’ XXXXA GATCCXXXXXX 3’ 3’ XXXXTCTAG GXXXXXX 5’5’ XXXXAGATCCXXXXXX 3’ 3’ XXXXTCTAGGXXXXXX 5’BamH IBgl II 一个限制酶单位一个限制酶单位（（U））指：指：在理想的反应条件（适在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为宜的缓冲液和反应温度，通常为37℃）下，）下，1h内内中完全中完全降解降解1 g DNA所需要的酶量。
所需要的酶量影响酶活性的因素很多，最重要的有：影响酶活性的因素很多，最重要的有：⑴⑴ DNA的纯度的纯度⑵⑵ DNA的甲基化程度的甲基化程度⑶⑶ 酶切反应的温度（通常为酶切反应的温度（通常为37℃ ））⑷⑷ DNADNA的分子结构的分子结构 ⑸⑸ 核酸内切限制酶的缓冲液核酸内切限制酶的缓冲液 在在““非最适的非最适的””反应条件下反应条件下, ,有些核酸内切限制酶识别序列的特有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生异性便会发生““松动松动””，从其，从其““正确正确””识别序列以外的其它位点识别序列以外的其它位点切割切割DNADNA分子，这种现象分子，这种现象叫星号活性叫星号活性用* *表示 （五）限制性核酸内切酶的消化反应（五）限制性核酸内切酶的消化反应 酶酶 切切 反反 应应 的的 基基 本本 步步 骤骤＋－电泳紫外分析37℃ 1h加反应液CKMBuffer (10X) 2.0 LddH2O 约约16.5 LDNA 0.2~1.0 gEnzyme 1～2UVolume 20.0 L 1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT （（一）一）DNA连接酶的发现连接酶的发现（（二）二） DNA连接酶作用特点连接酶作用特点（（三）三） DNA连接酶的反应条件连接酶的反应条件（（四）四）DNA连接的策略连接的策略二、二、 DNA连接酶及其应用连接酶及其应用 （一）（一）DNA连接酶的发现连接酶的发现环形环形DNADNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种 切口的酶存在。
切口的酶存在 首个首个DNADNA连接酶连接酶(ligase)—(ligase)———19671967年，年，大肠杆菌大肠杆菌DNA连连接酶接酶，，是大肠杆菌基因编码是大肠杆菌基因编码 1970年，发现了年，发现了T4DNA连接酶连接酶 ，， 由大肠杆菌由大肠杆菌T4噬菌体噬菌体基因编码的基因编码的 （二）（二）DNA连接酶作用的特点连接酶作用的特点A.A. 连接的连接的两条链两条链必须分别具有自由必须分别具有自由3’3’－－OHOH和和5’5’－－P P，而且这两个基团彼此，而且这两个基团彼此相邻相邻；；B. B. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程E.coli DNA连接酶连接酶 －连接具互补碱基黏性末端－连接具互补碱基黏性末端(最初研究表明），最初研究表明），现在研究可连接平末端；需现在研究可连接平末端；需NAD+辅助因子，活性低，不常用辅助因子，活性低，不常用T4DNA连接酶连接酶－连接具互补碱基黏性末端和平末端，－连接具互补碱基黏性末端和平末端，需需ATP辅助因子，活性高，常用辅助因子，活性高，常用。
是两条链－是两条链－因此不能将两条单链连接起来或使单链因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来环化起来 OH P × ×是相邻的－是相邻的－因此不能封闭因此不能封闭gap，只能封闭，只能封闭nick.gap NONick OK DNA 连接酶连接的作用机制连接酶连接的作用机制⑴ E(E(酶酶) )＋＋ATP→EATP→E－－AMPAMP＋＋ppippi E(E(酶酶) )＋＋NAD→ENAD→E－－AMPAMP＋＋NMNNMN⑵ ⑵ E E－－AMPAMP ＋＋DNADNA＝＝DNADNA－－AMPAMP＋＋E E⑶⑶DNADNA上上的的3’3’－－OHOH对对被被活活化化的的磷磷原原子子进进行行亲亲核核攻攻击击，，形形成成磷酸二酯键，同时释放出磷酸二酯键，同时释放出AMPAMP （三）（三）T4DNA连接酶连接反应的条件连接酶连接反应的条件影响连接效率的因素有：影响连接效率的因素有：A. A. 温度（通常在温度（通常在4-15℃ 4-15℃ ））B. ATPB. ATP的浓度的浓度(10μM／／L - 1M／／L )C. C. 连接酶浓度（连接酶浓度（一般平末端大约需一般平末端大约需1 1～～2U2U，黏性末端，黏性末端仅需仅需0.1U0.1U））D. D. 反应时间（通常连接过夜）反应时间（通常连接过夜）E. E. 插入片段和载体片段的摩尔比（插入片段和载体片段的摩尔比（ 1 1∶ ∶1 1～～5 5∶ ∶1 1）） （四）（四）T4 DNA连接酶对目的连接酶对目的DNA片段片段和载体连接的一般方案和载体连接的一般方案1．连接反应一般在灭菌的．连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。
离心管中进行2．．10μl体积反应体系中：取载体体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定，加入一定比例的外源比例的外源DNA 分子（一般线性载体分子（一般线性载体DNA分子与外源分子与外源DNA分子摩尔数为分子摩尔数为1∶ ∶1～～5∶ ∶1），补足），补足ddH2O 至至8μl3．轻轻混匀，稍加离心，．轻轻混匀，稍加离心，56℃水浴水浴5min后，迅速转入后，迅速转入冰浴4．加入含．加入含ATP的的10×Buffer 1μl，，T4 DNA连接酶合适单连接酶合适单位，位， 用用ddH2O 补至补至10μl，稍加离心，在适当温度（一，稍加离心，在适当温度（一般般14-16℃）连接）连接8-14hr 粘性末端粘性末端DNA片段的连接－片段的连接－DNA连接酶连接法连接酶连接法NickNick 平末端平末端DNA片段的连接－末端同聚物加尾法片段的连接－末端同聚物加尾法3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸转移酶末端核苷酸转移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’3’3’5’5’AAAAATTTTDNADNA聚合酶聚合酶和和T4DNAT4DNA连接酶连接酶 平末端平末端DNA片段的连接－衔接物连接法片段的连接－衔接物连接法 衔接物衔接物(linker)(linker)，也叫接头，也叫接头，，是有人工化学合成的一段是有人工化学合成的一段10-10-1212个核苷酸组成，具有有个核苷酸组成，具有有1 1个或几个限制性酶切位点的平末端的个或几个限制性酶切位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。
双链寡核苷酸短片段GGATCCCCTAGG+BamHI切割切割GATCCG连接酶＋经连接酶＋经BamHI切割的切割的pBR322GCCTAGBamHI衔接物衔接物dsDNAGGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG连接酶连接酶重组重组DNA分子分子GATCCGGCCTAG （（一）大肠杆菌一）大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I（（二）二）Klenow片段片段酶酶（（三）三）T4 DNA聚合酶聚合酶（（四）逆转录酶（反转录酶）四）逆转录酶（反转录酶）三、三、DNA聚合酶及其应用聚合酶及其应用 （一）（一） 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I （（EColi DNA pol I）） 是是Kornberg A. 1956年首先从大肠杆菌年首先从大肠杆菌EColi 细胞中分离细胞中分离出来的它是一种多功能性的酶，包括出来的它是一种多功能性的酶，包括 3 3种不同的酶活力：种不同的酶活力：A.5′- 3′聚合酶活性聚合酶活性 （模板，（模板， 带带3′－－OH游离基团的引物、游离基团的引物、4dNTPs、、 Mg2+ ））B.双链特异性的双链特异性的5'→3'核酸外切酶活性核酸外切酶活性C.3'→5'核酸外切酶活性。
核酸外切酶活性D.从游离的双链或单链从游离的双链或单链DNA的的3′端降解不过对于双链的降解可端降解不过对于双链的降解可被被5′-3′的多聚活性所抑制主要是校正作用的多聚活性所抑制主要是校正作用CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPol I + Mg2+＋ 4dNTPsATAGCCTCCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTACCGATAGCCTGGCTATCGGAPol I + Mg2+ ＋ 4dNTPsCCGATAGCCTGGCTAPol I + Mg2+ T 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I 的三种用途的三种用途A. 利用缺口转移法制备高比活度的利用缺口转移法制备高比活度的DNA探针探针 利用其利用其5′--3′的外切酶活性及其聚合酶活性的外切酶活性及其聚合酶活性B. 用于用于DNA连接前的大缺口填充连接前的大缺口填充 利用利用5′--3′的聚合酶活性的聚合酶活性C. 用于用于DNA的序列分析的序列分析 利用利用5′--3′的聚合酶活性的聚合酶活性 大肠杆菌聚合酶大肠杆菌聚合酶I的应用示例的应用示例缺口转移制备探针缺口转移制备探针Pol I + Mg2++［［αα－－32P］］ dNTPs （二）（二） Klenow片段酶片段酶KlenowKlenow片段片段是大肠杆菌聚合酶是大肠杆菌聚合酶 I I 全酶经枯草杆菌蛋全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，分子量为白酶处理后产生的大片段酶分子，分子量为76KD 76KD 。
酶催活性：酶催活性：⑴5’ →3’ ⑴5’ →3’ 的聚合酶活性的聚合酶活性 ⑵3⑵3’ →5’ →5’ 的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性CCGATAGCCTGGCTACCGATAGCCTGGCTAKlenow+Mg2+ KlenowKlenow片段的主要用途（片段的主要用途（利用利用5’ →3’ 5’ →3’ 的聚合酶活性）的聚合酶活性）⑴⑴修补限制性酶消化修补限制性酶消化DNADNA形成的形成的3′3′隐蔽末端隐蔽末端⑵⑵标记标记DNADNA片段的末端片段的末端 底物用［底物用［αα－－3232P P］－］－dNTPsdNTPs ⑶cDNA⑶cDNA克隆中第二链克隆中第二链cDNAcDNA的合成的合成 ⑷DNA⑷DNA序列的测定序列的测定 （三）（三） T4DNA聚合酶聚合酶T T4 4DNADNA聚合酶是聚合酶是 从从T4T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，酶催活性：酶催活性：⑴5′→3′⑴5′→3′的聚合酶活性的聚合酶活性⑵3 ′→ 5 ′⑵3 ′→ 5 ′的核酸外切酶活性。
的核酸外切酶活性其外切酶活性要比大肠杆菌其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶聚合酶 I I 的活性高的活性高200200倍比比Klenow Klenow 片段酶片段酶强强100100～～1,0001,000倍 因此，可以综合利用这两种活性进行因此，可以综合利用这两种活性进行取代合成取代合成反应：反应：如果反应体系中仅存在一种如果反应体系中仅存在一种dNTPdNTP或没有底物时，这时或没有底物时，这时T4DNAT4DNA聚合聚合酶就会表现出酶就会表现出3 ′→ 5 ′3 ′→ 5 ′外切酶活力，从双链外切酶活力，从双链DNADNA的的3′3′开始降开始降解，直到露出底物解，直到露出底物dNTPdNTP相同的碱基然后就在此位置发生合成和相同的碱基然后就在此位置发生合成和取代反应取代反应CGTCGCGCAGCGCGTCGCGCAGCGdTTPMg++CGTGCAGCGαα－－32P －－dNTPsMg++ T4DNA聚合酶的用途聚合酶的用途1 1、利用取代合成反应制备探针、利用取代合成反应制备探针2 2、标记具有平末端的或具有、标记具有平末端的或具有3’3’－隐蔽末端－隐蔽末端的的DNADNA片段片段利用较强的利用较强的3 ′→ 5 ′3 ′→ 5 ′外切酶活性和外切酶活性和 5′→3′ 5′→3′聚合活性聚合活性3 3、用于、用于DNADNA序列分析序列分析 （四）（四） 逆转录酶逆转录酶—Reverse transcriptase逆转录酶逆转录酶 是一种依赖是一种依赖RNARNA的的DNADNA聚合酶。
聚合酶此酶首先是此酶首先是19701970年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的这两这两个课题组的论文都发在了同一期的《个课题组的论文都发在了同一期的《NatureNature》杂志上》杂志上最普遍使用的是从鸟类骨髓母细胞瘤病毒（最普遍使用的是从鸟类骨髓母细胞瘤病毒（AMVAMV）分离出来的分离出来的活性：活性：一种可以有效地将一种可以有效地将mRNAmRNA反转录成反转录成DNADNA的酶，其产物称为的酶，其产物称为cDNA(complementary DNA).cDNA(complementary DNA).主要用途是主要用途是 将将mRNAmRNA转录成转录成cDNAcDNA以制备基因片段以制备基因片段3’ AAAAAAAA AAAAAAAA5’ TTTTTTTTTAAAAAAAATTTTTTTTT5’ TTTTTTTTT3’ AAAAAAAA 碱水解碱水解反转录酶＋反转录酶＋oligo(dT)带带poly(A)的的mRNAcDNASI核酸酶核酸酶Klenow酶酶 （（一）末端转移酶（一）末端转移酶（terminal transferase））（（二）二） SI核酸酶（核酸酶（SI nuclease））（（三）碱性磷酸酶三）碱性磷酸酶四、修饰性工具酶四、修饰性工具酶 （一）末端转移酶（一）末端转移酶l末末端端转转移移酶酶是是一一类类不不依依赖赖于于DNA模模板板的的DNA聚聚合合酶。
酶l特特性性：：该该类类酶酶可可以以在在没没有有模模板板链链存存在在的的情情况况下下，，将将核核苷苷酸酸连连接接到到dsDNA或或ssDNA的的在在3’－－OH特别是对于平末端的双链特别是对于平末端的双链DNA末端加尾十分有用末端加尾十分有用l最最常常见见的的用用途途：：给给外外源源DNA片片段段及及载载体体分分子子加加上上互互补补的的同同聚聚物物尾尾巴巴，，以以创创造造黏黏性性末末端端，，便便于于重重组 平末端平末端DNA片段的末端加尾连接法片段的末端加尾连接法3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸转移酶末端核苷酸转移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’3’3’5’5’AAAAATTTTDNADNA聚合酶和聚合酶和T4DNAT4DNA连接酶连接酶 （二）（二）SI核酸酶核酸酶 这是一种从米曲霉（这是一种从米曲霉（Aspergillus oryzaeAspergillus oryzae）中）中分离的分离的高度单链特异的外切酶高度单链特异的外切酶活性：活性：可以降解单链可以降解单链DNADNA或或RNARNA或双链的单链区或双链的单链区ssDNA或或RNA5’3’SI酶、酶、 Zn2+、、pH4.55’dNMPs或或5’rNMPsSI酶、酶、 Zn2+、、pH4.5+带缺口的带缺口的DNA或或RNASI酶、酶、 Zn2+、、pH4.5黏性末端黏性末端平末端平末端 其主要用途有：其主要用途有：⑴⑴ 在 在cDNA合成过程中，切开合成过程中，切开cDNA的发夹末端；的发夹末端；⑵⑵ 载体构建过程中，切去 载体构建过程中，切去DNA片段的单链尾巴，片段的单链尾巴， 形成平末端结构。
形成平末端结构 3’ AAAAAAAA AAAAAAAA5’ TTTTTTTTTAAAAAAAATTTTTTTTT5’ TTTTTTTTT3’ AAAAAAAA 发夹结构的切除发夹结构的切除TTAAAATT单链尾巴的切除单链尾巴的切除 （三）（三） 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 从大肠杆菌中分离的细菌碱性磷酸酶（从大肠杆菌中分离的细菌碱性磷酸酶（Bacterial Alkaline Bacterial Alkaline PhosphatasePhosphatase）简称）简称BAP BAP 从小牛肠中分离的叫小牛肠碱性磷酸酶（从小牛肠中分离的叫小牛肠碱性磷酸酶（ Calf Intestinal Calf Intestinal Alkaline PhosphataseAlkaline Phosphatase）） ，简称，简称CIPCIP，用的广泛用的广泛酶催功能：酶催功能： 脱磷酸作用，将单链或双链脱磷酸作用，将单链或双链DNADNA或或RNA5’RNA5’－－P P转化成转化成5’5’－－OHOH其主要用途有：其主要用途有：⑴⑴在用在用32P标记标记DNA 5′端之前，去除端之前，去除5′端的磷；端的磷；⑵⑵在在DNA重组技术中，去除重组技术中，去除DNA片段的片段的5′磷酸，防止载体的自身磷酸，防止载体的自身环化，提高重组子比例。
环化，提高重组子比例 载体去磷防止自连的应用示例载体去磷防止自连的应用示例POHPOHOHOHOHOHPOHPOHOHOHOHOH连接酶连接酶连接酶连接酶连接酶连接酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶CIP寄主修复缺口寄主修复缺口载体自连或产载体自连或产生二具体等生二具体等 基因工程的基本步骤基因工程的基本步骤基因分基因分离酶切离酶切载体酶切载体酶切基因和载基因和载体连接体连接导入细菌导入细菌重组质粒繁殖重组质粒繁殖重组克隆的选择重组克隆的选择序列分析和基序列分析和基因表达等研究因表达等研究导入导入植物植物细胞细胞 结束语结束语谢谢大家聆听！！！谢谢大家聆听！！！81 。