专题讲座# 谷胱甘肽及其抗氧化作用今日谈 程 时 丁海勤(北京大学医学部生物物理学系, 北京 100083) 目录 一、 GSH 结构与分布 二、 GSH 的抗氧化作用 ( 一) GSH 的解毒及细胞保护功能 1. GSH 亲核进攻 ))) 结合反应的解毒作用 2. GSH 抗自由基和抗氧化应激作用 ( 二) 氧化应激诱导 GSH 合成及其机制 谷胱甘肽 ( glutathione, GSH) 是广泛分布于哺 乳动物、 植物和微生物细胞内, 最主要的、 含量最丰 富的含巯基的低分子肽1888 年 De Rey -Pailhade 首次从酵母中分离出天然型 GSH, 1921 年 Hopkins 第一次制备了 GSH 结晶, 1929 年 Pirie 和 Pinhey 通 过对该三肽的生理化学研究, 得出了 GSH 的正确结 构式, 1935 年首次人工合成 GSH此后对 GSH 的 研究未曾中断过, 至今对 GSH 的认识也没有完结 一、 GSH结构与分布 GSH[ 1]是由谷氨酸( glutamate) 、 半胱氨酸( cys - teine) 及甘氨酸 ( glycine) 组成的三肽, 有氧化型 ( GSSG) 和还原型( GSH) 两种形式。
GSH 不像大多 数多肽能被多肽酶在 N 末端氨基酸的 A -羧基处分 解, 它的 N 末端肽键由谷氨酸的 C -羧基和半胱氨酸 的氨基构成( 图 1) 这种特殊的结构安排可抵抗细 图 1 谷胱甘肽( C -谷氨酰半胱氨酰甘氨酸) 结构式 N 末端肽键由谷氨酸的C - 羧基和半胱氨酸的氨基构成 胞内肽酶对 GSH 的降解, 同时还可防止被分布于质 膜上的 C -谷氨酰转肽酶 ( C -glutamyltranspeptidase, C -GTP) 的水解GSH C 末端的羧基可保护分子免 受细胞内 C -谷氨酰环化转移酶( C -glutamyl cyclo - transferase) 的裂解GSH 分子中的 C -谷氨酰基有 助于保持该分子在细胞内的完整因此, GSH 的特 殊结构使得它在细胞内稳定它只能被某些特定 的、 存在于质膜外侧的 C -GT P 清除GSH 分子中 半胱氨酸上的巯基, 是其发挥生物学功能所必需的 GSH 以高浓度( 0. 1~ 10 mmol/ L) 普遍存在于 微生物、 植物和所有哺乳动物细胞中, 肝脏 GSH 含 量最高, 大鼠肝细胞内 GSH 浓度可达 10 mmol/ L。
然而 GSH 在细胞器中的分布是不均匀的, 真核细胞 有三个 GSH 库, 近 90% 的 GSH 分布于胞质, 近 10%分布于线粒体, 其它极少部分分布在内质网 GSH 粒体虽然只占细胞 GSH 总量的十分之 一, 但它粒体的作用十分重要线粒体是细胞 氧化呼吸场所, 在生理条件下, 经氧化呼吸可通过酶 促反应或非酶促反应产生少量氧自由基, GSH 与其 相关的酶是一道重要的抗自由基防线线粒体缺乏 合成 GSH 的酶, 它只能由胞质供给, 同时线粒体又 不能将被氧化的 GSSG 输出到该细胞器外, 因此在 生理( 如衰老) 或病理性氧化应激状态下, 细胞死亡 与线粒体 GSH 浓度的相关性比与胞质 GSH 浓度的 相关性更大Wahllaher 等认为 GSH 粒体中的 浓度( 10 mmol/ L) 高于在胞质中的浓度( 7 mmol/ L) , 但也有人认为线粒体中的 GSH 浓度( 4 mmol/ L) 小于它在胞质中的浓度( 5 mmol/ L) Brocks 等 认为线粒体 GSH 与胞质 GSH 在分布与代谢上是完 全无关的与胞内 GSH 浓度相比, 血浆 GSH 含量 甚微, 只及胞内的千分之一, 而且 GSH 在血浆中的 半衰期( 1. 6 分钟) 比在胞质中 ( 2~ 3 小时) 短得多。
内质网中的 GSH 可与其它化合物( 如半胱氨酸、 辅 酶 A 和某些蛋白质的半胱氨酸残基) 的巯基形成混 合二硫键, 因此内质网中 GSH 与 GSSG 的比例约为 3 : 1, 而在胞质和线粒体中, 约 95% 以上的 GSH 是 #85#生理科学进展 2002年第 33 卷第 1 期 以还原形式存在的, 所以 GSH/ GSSG 比例远超过 10 : 1, 此为细胞内环境处于还原态的基础 二、 GSH的抗氧化作用 迄今为止的研究表明, GSH 作为哺乳动物细胞 内最主要的非蛋白巯基和含量最丰富的低分子量多 肽, 直接和间接参与许多功能活动, 例如: ( 1) 参与 细胞内许多化合物、 药物及激素( 雌激素、 前列腺素 等) 的代谢; ( 2) 通过/ C -谷氨酰循环0储存和运输半 胱氨酸, 是半胱氨酸的储存库; ( 3) 参与 DNA、 RNA 和蛋白质等大分子的生物合成; ( 4) 协同葡萄糖 -6 - 磷酸脱氢酶和辅酶 I 维持红细胞的完整性, 防止血 红蛋白氧化变性; ( 5) 作为各种代谢途径中的某些 酶( 如乙二醛酶、 马来酰乙酰乙酸异构酶和前列腺内 过氧化异构酶等) 的辅助因子; ( 6) 对内、 外源性毒 物的解毒作用; ( 7) 与其相关酶共同保护细胞内的 蛋白质、 脂质等结构成分使之不被氧化, 并保持 Vit C 和 Vit E 的还原状态。
以下仅就 GSH 解毒、 抗氧 化及细胞保护作用进行概述 ( 一) GSH 的解毒及细胞保护功能 早于上世 纪 80 年代, Videla 在总结 GSH 抵抗诱导氧化应激 的化学物质引起细胞毒作用的基础上, 将 GSH 的保 护作用归纳为三种机制: ( 1) GSH 的亲核进攻)) ) 结合反应; ( 2) GSH 对脂质过氧化的抑制作用; ( 3) GSH 对自由基的清除作用根据既往与近年的研 究成果, 本文对这三种保护机制进行说明和补充 1. GSH 亲核进攻) )) 结合反应的解毒作用: 由 于GSH 分子特性, 决定了该分子对于外源性化学毒 物的代谢中间产物, 以亲核进攻)) ) 结合反应方式 进行解毒( 亲核系指易与带正电荷基团结合) Ket- ter 指出: GSH 分子中的半胱氨酸残基上的巯基具 有强的亲核性质, 可通过亲核取代和加成作用使有 毒亲电物质极性降低、 毒性减弱GSH 分子中的谷 氨酸与含有亲核性硫原子的半胱氨酸均属于极性氨 基酸, 并带负电荷, 因此可以提高与之结合的亲电子 物质分子中的亲脂部分的水溶性( 亲电子物质系指 易与带负电荷基团结合的物质) , 使其易于清除。
GSH 的分子量为 307, 形成加合物后的分子量显然 大于 300, 适于从胆汁排出Lee 等[ 2]观察到肝细胞 中的 GSH 调节牛磺胆酸在肝内的转运; 当胞内 GSH 水平降低时, 牛磺胆酸由肝细胞排出受阻, 当 胞内 GSH 水平升高时, 促进牛磺胆酸排出GSH 中C -谷氨酰基的 N 末端能决定 GSH 与有关酶相互 作用的专一性, 有利于酶促结合反应除此重要特 性外, GSH 在细胞中的高含量也为其竞争结合有毒 的亲电子物质提供有利条件GSH 对亲电子物质 的亲核进攻所导致的结合反应, 可以是非酶促的自 然结合, 也可以是酶促结合反应参与酶促结合反 应的酶为谷胱甘肽 -S -转移酶( glutathione -S - trans - ferase, GST ) GST 是一组多功能的解毒酶[ 3], 广 泛分布于哺乳类、 鸟类、 植物和微生物体内, 存在于 各组织细胞的胞质内Habig 指出, GST 是启动 GSH 结合反应的关键酶, 因为该酶分子上具有一个 能与 GSH( 第一底物) 中谷氨酰基结合的部位, 使与 之结合的 GSH 分子中的巯基攻击亲电子物质( 第二 底物) 的亲电子中心, 产生硫醚连接的谷胱甘肽结合 物。
GST 是由 23~ 28 kD 两个亚单位构成的同二 聚体或异二聚体目前从大鼠肝细胞中至少提纯 7 种同工酶( AA、 A、 B、 C、 D、 E 和 M) , 从人肝细胞中提 纯了 5种同工酶( A、 B、 C、 D 和 E) 其中 GST B 已 鉴定是一种存在于肝细胞、 肾近曲小管、 小肠上皮细 胞内的配体蛋白( Ligandin) , 与其它蛋白质分子一 样可以非酶形式直接结合胆红素、 靛氰氯等有毒物 质, 并参与对线粒体中血红素( heme) 的释放和对 NADPH 细胞色素 P450 产物的解毒作用( 见后) 也有人根据 GST 底物的特异性及适宜的 pH 条件, 将其分为 GST -烷基、 芳基、 芳烷基、 链烯和环氧化物 -S -转移酶, 进而表明酶的多样性和底物的广谱特 性尽管 GST 是一种活性较弱的酶, 然而在一般情 况下, 肝微粒体中 NADPH 细胞色素 P450 促外源 性化学毒物转化的速率缓慢, 以及 GST 的丰富含 量, 便足以保证对上述在转化过程中所产生的亲电 子代谢物起解毒作用已有大量实验证实, 当组织 GSH 含量和 GST 活性明显下降时, 某些外源性化 学毒物如苯乙烯、 对乙酰氨基苯乙醚、 松香、 溴苯、 醋 氨酚和黄曲霉素 B1 等, 均可引起靶器官细胞严重 损害, 甚至引起细胞死亡。
反之, 如果预先给予含巯 基的物质, 如半胱氨酸或丙硫氧嘧啶等以维持或提 高胞内 GSH 水平, 则可大大减轻对某些化学毒物引 起的肝损伤从 GSH 解毒机制分析, GSH 作为强 亲核物质, 可为亲电代谢物或其它氧化代谢物提供 巯基, 亲电子代谢物往往是外源性毒物经微粒体 NADPH 细胞色素 P450 活化代谢后产生的烷化、 芳 化或酰化中间产物若 GSH 浓度正常, 这种亲电子 中间物可成为 GSH 的亲核进攻对象, 发生结合反 应,形成无毒结合物但当 GSH 浓度低于临界值 时, 这些亲电子中间物可与生物大分子结合, 改变细 胞内的生化环境和细胞结构, 对细胞造成严重的应 激损伤, 甚至导致细胞死亡总之, GSH 结合反应 #86#生理科学进展 2002 年第 33卷第 1期 的解毒机制首先是与亲电子代谢物形成 GSH 加合 物, 经 g -GTP 和半胱氨酰甘氨酸酶转移谷酰氨基, 去掉甘氨酸, 再经 N-乙酰化酶作用, 最终形成惰性 产物硫醚氨酸被排出体外 值得提出的是许多抗癌药物在细胞内形成亲电 子代谢物, 胞内高水平的 GSH 加速化疗药的灭活, 导致肿瘤化疗失败研究表明, 胞内 GSH 水平增 高与肿瘤化疗耐药性密切相关。
已发现恶性肿瘤患 者红细胞 GSH 水平明显高于正常人, 消化系统恶性 肿瘤、 恶性淋巴瘤和肺癌等晚期患者红细胞 GSH 明 显高于早期患者, 化疗无效患者化疗前红细胞 GSH 明显高于化疗有效患者因此, 从调节肿瘤细胞 GSH 水平的角度消除肿瘤细胞化疗耐药性, 是提高 肿瘤疗效的一个途径 2. GSH 抗自由基和抗氧化应激作用: 关于自 由基( free radical) 与氧化应激( oxidative stress) 的概 念[4]不予以赘述与生命活动有关的自由基是氧 自由基( 包括超氧阴离子 # O-2, 氢过氧自由基 HO- # 2 及羟 自由基#OH 等) 或活 性氧 ( reactive oxygen species, ROS) , 后者包括氧自由基及 H2O2, 单线态 氧1$gO2等细胞在正常代谢中产生自由基, 线粒 体在电子传递过程中所产生的氧自由基占细胞内氧 自由基的 80%以上在生理状态下, 氧自由基参与 正常的生理、 生化过程, 调节花生四烯酸代谢, 刺激 吞噬细胞和中性粒细胞的吞噬杀菌功能和免疫活性 等因此, 机体需要通过自由基生成与清除的平衡, 来维持其有利而无害的生理性适宜浓度。
当正常的 氧化/ 抗氧化平衡稳态被破坏时, 就造成氧化应激 广义说来, 氧化应激是体内 ROS 浓度升高的一种状 态因此, 引起氧化应激主要有两种可能性; 一种是 使ROS 增多。