凝胶迁移或电泳迁移率试验（EMSA）能够：（1）研究DNA结合蛋白和其相关DNA结合序列相互作用；（2）可用于DNA定性和定量分析；（3）用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列相互作用试验方法原理凝胶迁移或电泳迁移率试验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一个研究DNA结合蛋白和其相关DNA结合序列相互作用技术，可用于定性和定量分析这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，现在已用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列相互作用通常将纯化蛋白和细胞粗提液和32P同位素标识DNA或RNA探针一同保温，在非变性聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合探针DNA-复合物或RNA-复合物比非结合探针移动得慢同位素标识探针依研究结合蛋白不一样，可是双链或是单链当检测 如转录调控因子一类DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液在检测RNA结合蛋白时，依据目标RNA结合蛋白位置，可用纯化或部分纯化蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液竞争试验中采取含蛋白结合序列DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异）， 和其它非相关片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白特异性。
在竞争特异和非特异片段存在下，依据复合物特点和强度来确定特异结合试剂、试剂盒[γ-32P]ATPT4多聚核苷酸激酶Nuclease-Free WaterT4多聚核苷酸激酶缓冲液醋酸铵TE无水乙醇TBE buffer重蒸水甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺甘油过硫酸铵TEMED（四甲基乙二胺）EMSA Gel-Shift结合缓冲液溴酚蓝仪器、耗材水浴锅PCR仪离心机电泳仪电泳槽试验步骤一、探针标识 1. 以下设置探针标识反应体系： （1）待标识探针 (1.75 pmol/微升) ：2微升 （2）T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) ：1微升 （3）Nuclease-Free Water ：5微升 （4）[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) ：1微升 （5）T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升) ：1微升 （6）总体积 10微升 （7）根据上述反应体系依次加入多种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混匀 2. 使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。
3. 加入1微升探针标识终止液，混匀，终止探针标识反应 4. 再加入89微升TE，混匀此时能够取少许探针用于检测标识效率通常标识效率在30%以上，即总放射性30%以上标 记到了探针上为试验简便起见，通常无须测定探针标识效率 5. 标识好探针最好立即使用，最长使用时间通常不宜超出3天标识好探针能够保留在-20℃ 二、 探针纯化 通常为试验简便起见，能够无须纯化标识好探针在有些时候，纯化后探针会改善EMSA电泳结果如需纯化，能够根据如 下步骤操作： 1. 对于100微升标识好探针，加入1/4体积即25微升5 M醋酸铵，再加入2体积即200微升无水乙醇，混匀 2. 在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜 3. 在4℃，12 000 g-16 000 g离心30分钟小心去除上清，切不可触及沉 4. 在4℃，12 000 g-16 000 g离心1分钟小心吸去残余液体微晾干沉淀，但不宜过分干燥 5. 加入100微升TE，完全溶解沉淀标识好探针最好立即使用，最长使用时间通常不宜超出3天标识好探针能够保留在 -20℃ 三、EMSA 胶配制 1. 准备好倒胶模具。
能够使用常规灌制蛋白电泳胶模具，或其它合适模具最好选择能够灌制较薄胶模具，方便于干胶等后续操作为得到愈加好结果，能够选择可灌制较大 EMSA 胶模具 2. 根据以下配方配制20毫升4％聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不一样百分比Acr/Bis对结果影响不大) （1）TBE buffer (10X)： 1毫升 重蒸水 16.2毫升 （2）39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)： 2毫升 （3）80% 甘油： 625微升 （4）10% 过硫酸铵 (ammonium persulfate) ：150微升 （5）TEMED ：10微升 3. 根据上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并立即加入到制胶模具中避免产生气泡， 并加上梳齿假如发觉很轻易形成气泡，能够把一块制胶玻璃板进行硅烷化处理 四、EMSA结合反应 1. 以下设置EMSA结合反应 阴性对照反应： (1）Nuclease-Free Water ：7微升 （2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升 （3）细胞核蛋白或纯化转录因子： 0微升。
（4）标识好探针 ：1微升 （5）总体积 ：10微升 样品反应： （1）Nuclease-Free Water ：5微升 （2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升 （3）细胞核蛋白或纯化转录因子 ：2微升 （4）标识好探针： 1微升 （5）总体积： 10微升 探针冷竞争反应： （1）Nuclease-Free Water ：4微升 （2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升 （3）细胞核蛋白或纯化转录因子： 2微升 （4）未标识探针： 1微升 （5）标识好探针： 1微升 （6）总体积 ：10微升 突变探针冷竞争反应： （1）Nuclease-Free Water ：4微升 （2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升 （3）细胞核蛋白或纯化转录因子 ：2微升 （4）未标识突变探针： 1微升 （5）标识好探针： 1微升 （6）体积 ：10微升 Super-shift反应： （1）Nuclease-Free Water：4微升 （2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升 （3）细胞核蛋白或纯化转录因子：2微升。
（4）目标蛋白特异抗体 ：1微升 （5）标识好探针：1微升 （6）总体积 ：10微升 2. 根据上述次序依次加入多种试剂，在加入标识好探针前先混匀，而且室温(20-25℃)放置10分钟，从而消除可能发生探针和蛋白非特异性结合，或让冷探针优先反应然后加入标识好探针，混匀，室温(20-25℃)放置20分钟 3. 加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA结合，建 议尽可能使用无色EMSA/Gel-Shift上样缓冲液假如对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，能够在无色上样缓冲液里面添加极少许蓝色上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可 五、 电泳分析 1. 用0.5XTBE作为电泳液根据10V/厘米电压预电泳10分钟预电泳时候假如有空余上样孔，能够加入少许稀释好1X EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行 2. 把混合了上样缓冲液样品加入到上样孔内在多出某个上样孔内加入10微升稀释好1XEMSA/Gel-Shift上样缓冲液 (蓝色)，用于观察电泳进行情况 3. 根据10 V/厘米电压电泳。
确保胶温度不超出30℃，假如温度升高，需要合适降低电压电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓 冲液中蓝色染料溴酚蓝至胶下缘1/4处，停止电泳 4. 剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大比较厚实滤纸小心取下夹有EMSA胶胶板，用吸水纸或一般草纸大致擦干胶板边 缘电压液小心打开两块胶板中上面一块(注：通常选择先移走硅烷化那块玻璃板)，把滤纸从EMSA胶一侧逐步覆盖住整个EMSA胶，轻轻把滤纸和胶压紧滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟)，轻轻揭起滤纸，这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来把滤纸侧向下，放平，在EMSA胶上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡 5. 干胶仪器上干燥EMSA胶然后用X光片压片检测，或用其它合适仪器设备检测其它一、常见问答1. 什么是凝胶迁移或电泳迁移率试验？ 凝胶迁移或电泳迁移率试验（EMSA）是一个研究DNA结合蛋白和其相关DNA结合序列相互作用技术，可用于定性和定量分析这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，现在已用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列相互作用 通常将纯化蛋白和细胞粗提液和32P同位素标识DNA或RNA探针一同保温，在非变性聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合探针。
DNA复合物或RNA复合物比非结合探针移动得慢同位素标识探针依研究结合蛋白不一样，可是双链或是单链当检测如转录调控因子一类DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液在检测RNA结合蛋白时，依据目标RNA结合蛋白位置，可用纯化或部分纯化蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液竞争试验中采取含蛋白结合序列DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白特异性在竞争特异和非特异片段存在下，依据复合物特点和强度来确定特异结合 2. 试验中需要用到什么试剂？ 凝胶迁移试验需要结合蛋白，可起源于纯化或部分纯化蛋白，或粗核和胞质抽提液还必需制备同位素标识DNA或RNA通常，DNA核苷酸探针用32P和T4多核苷酸激酶来作末端标识，同位素标识RNA用噬菌体RNA聚合酶和同位素标识核苷酸在体外合成Promega企业Riboprobe/sup系统（a,b）可用于同位素标识RNA体外合成，DNA 5'末端标识系统，用于制备DNA探针，结合反应所需组分有：含盐溶液（氯化镁，氯化钠，或氯化钾）、缓冲体系（Tris-HCl或HEPES）、还原剂（DTT）、甘油、非特异竞争DNA（poly（dI:dC）dI:dC），也可能含非离子去污剂。
在结合蛋白和同位素标识探针作用后，在非变性聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物，随立即凝胶干燥并放射自显影，或用PhosphorImage/sup分析 3. 凝胶迁移试验系统提供了什么试剂？ Promega企业提供一个凝胶迁移试验系统检测DNA结合蛋白，系统可作为这类试验一个阳性对照系统包含目标寡核苷酸，对照DNA结合蛋白，结合缓冲液，用于寡核苷酸探针末端标识所需试剂Core 系统包含含重组AP2蛋白（AP2抽提液）大肠杆菌抽提液和AP2同源寡核苷酸AP2抽提液是从表示AP2蛋白大肠杆菌中提取另外，Core系统还含SP1同源寡核苷酸，凝胶迁移结合缓冲液，和能作20次对照试验HeLa核抽提液Complete系统含另外5个双链寡核苷酸，分别是AP1、OCT1、CREB、NF-kB、 TFIID结合位点同源序列这些寡核苷酸能够在末端标识后用作特异性探针，或在竞争试验中用作非特异性探针 4. 成功进行凝胶迁移试验，需要优化哪些原因？ 凝胶迁移试验在理论上很简单也很快速，但要成功地进行凝胶迁。