病毒感染细胞试验整体步骤及原理 目标基因不能直接整合到大多数真核细胞，常见手段是将目标基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表示满足试验需求1、病毒种类病毒有很多个，常见有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒一个构建siRNA / miRNA慢病毒载体，和化学合成siRNA 和基于瞬时表示载体构建一般 siRNA 载体相比，首先能够扩增替换瞬时表示载体使用，其次，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态细胞，而且在感染后能够整合到受感染细胞基因组，进行长时间稳定表示1.1.2特点1） 直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞全部有感染作用，适合 RNAi 研究和体内试验中难于转染细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞) 2） 能够经过简单方法，在短时间内取得稳定表示特定基因多个细胞株3） 可用于基因敲除、基因诊疗和转基因动物研究4） 无需任何转染试剂，操作简便5） 能够依据用户需要制备多个标识1.1.3慢病毒包装简明步骤：1） 含有目标基因慢病毒 RNAi 干扰载体构建和质粒纯化提取。
2） 慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等 3） 培养 48hrs - 72hrs 左右，搜集含有病毒上清培养液 4） 病毒纯化和浓缩 5） 分装、- 80 ℃保留 6） 滴度测定目标基因检定，并出具检测汇报1.2、腺病毒1.2.1原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一个无包膜线状双链DNA病毒，其复制不依靠于宿主细胞分裂有近50个血清型，大多数Ad载体全部是基于血清型2和5，经过转基因方法替换E1和E3基因，降低病毒复制能力这些重组病毒仅在高水平表示E1和E3基因细胞中复制，所以是一个适适用于诊疗高效控制系统1.2.2特点1） 几乎能够感染全部类型细胞2） 能够取得复制缺点型 (E1 和 E3 缺失) 腺病毒3） 病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后能够达成 1012 PFU/mL，能有效进行增殖4） 腺病毒载体感染宿主范围比较广，制备轻易，操作简单.5） 感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高1.2.3腺病毒包装简明步骤1） 构建表示 siRNA/miRNA 腺病毒载体2） 采取 PacI 消化纯化质粒3） 消化好腺病毒表示载体转染 293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。
4） 将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒5） 分装，-80℃保留1.3、慢病毒和腺病毒比较慢病毒载体系统和腺病毒载体系统比较病毒表示系统慢病毒表示系统（Lentivirus）腺病毒表示系统（Adenovirus）病毒基因组RNA病毒双链DNA病毒复制自主复制自主复制是否整合病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表示外源基因病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时表示外源基因感染细胞类型感染分裂和不分裂细胞，适适用于难转染原代细胞（如神经细胞）及体内试验感染分裂和不分裂细胞表示风度中水平表示高水平表示表示时间慢（1-3天）快（1-2天）滴度滴度最高可达10*8pfU/ml滴度最高可达10*11pfU/ml克隆容量可插入不超出8kb外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低可插入高达8kb外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低免疫原性低免疫原性高免疫原性2、构建目标基因到载体2.1构建手段通常是依据原始质粒信息确定克隆方案，有以下两种手段1）假如原始质粒和载体有匹配酶切位点，采取对应内切酶切下对应片段，回收并连接到载体，酶切，并测序判定2）假如没有匹配酶切位点，则设计带有特殊接头引物进行PCR扩增，得到目标片段，采取对应内切酶切下对应片段，回收并连接到穿梭载体，酶切，并测序判定2.2质粒载体2.2.1概念能够进行自主复制环状DNA双链结构，包含真核生物细胞器（关键指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外环状脱氧核糖核酸(DNA)分子2.2.2特征质粒上常有抗生素抗性基因，比如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。
有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进真菌染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外DNA分子质粒在宿主细胞体内外全部可复制经过个些特征，大家能够把部分目标DNA片断构建在质粒中，经过转化入大肠杆菌中，利用选择培养基来筛选从而不停复制，来得到目标产物3、质粒DNA在大肠杆菌里转化连接上目标基因质粒转化大肠杆菌是为了让目标基因在大肠杆菌里扩增，然后提取质粒，以下是质粒DNA在大肠杆菌里转化三步骤3.1大肠杆菌感受态细胞制备1）从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于3mlLB培养基试管中，37℃振荡培养过夜2）取0.4ml菌液转接到40mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2~3h3）菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min4）4℃离心10min（4000r/min）5）倒出培养液，将管口倒置方便培养液流尽6）用冰浴0.1mol/L氯化钙10ml悬浮细胞沉淀，立即冰浴30min7）4℃离心10min（4000r/min）8）倒出上清液，用冰浴0.1mol/L氯化钙2ml悬浮细胞（冰上放置）9）分装细胞，200ul一份，4℃保留3.2质粒DNA转化1）取200ul新鲜制备感受态细胞，加入质粒DNA2ul混匀，冰浴30min2）离心管放到42℃保温90s3）冰浴2min4）每管加800ulLB液体培养基，37℃培养1h（150r/min）5）取合适体积（100ul）复苏细胞，涂布在选择性培养基上，正置30min6）倒置平皿37℃，12~16h，出现菌落3.3质粒提取步骤1）取1~4ml在LB培养基中培养过夜菌液，1转离心1min，弃上清2）加250ul溶液Ⅰ/RNaseA（溶液Ⅰ为细胞悬浮液）混合液，漩涡猛烈振荡直至菌体完全重新悬浮，室温静置1-2min。
3）加入250ul溶液Ⅱ（细胞裂解液），轻柔反复颠倒混匀5-6次室温放置1-2min，使菌体充足裂解，直至形成澄清裂解溶液4）加入350ul溶液Ⅲ（中和液），立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次，此时会出现白色絮状沉淀5）1室温离心10min，搜集上清6）将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2min7）1转离心1min，弃滤液8）加入500ul溶液PB（洗涤液）1转离心1min，弃滤液，目标是将硅胶膜上吸附蛋白、盐等杂质洗脱，以取得高质量质粒DNA9）加入500ul溶液W（去盐液），1转离心1min，弃滤液，反复一次10）1转离心3min，以根本去除纯化柱中残留液体11）将DNA纯化柱置于新离心管中，悬浮滴加50-100ul溶液Eluent（为无菌双蒸水，PH为8.0-8.5），室温放置2min12）1转离心1min，此时管底即为高纯度质粒DNA，质粒于-20℃保留质粒提取步骤：吸收液体培养基于1.5ml离心管中1转离心1min，弃上清，吸收培养基反复离心弃上清离心，留取少许菌液作为菌种保留，可直接置于-20℃——加250ulBufferS1悬浮细菌，悬浮均匀——加250ulBufferS2温和充足上下翻转4-6次混合均匀，使菌体裂解——加350ulBufferS3温和上下翻转1离心10min——取上清液转移到专用制备管（2ml）1转离心1min，弃滤液——加500ulBufferW11转离心1min，弃滤液——加500ulBufferW21转离心1min，弃滤液，反复一遍——将制备管置回2ml离心管1转离心1min——将制备管移入新1.5ml离心管中，加60~80ulEluent或离子水，室温1min1转离心1min——移去制备管，将有质粒离心管于4℃或是-20℃保留4、质粒DNA和其它包装质粒共转染293T细胞产生病毒（即病毒包装）4.1名词解释4.1.1293T细胞是由293细胞派生, 表示SV40大T抗原人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表示多种目标蛋白, 或是用以包装病毒。
4.1.2脂质体：一些细胞质中天然脂质小体，可作为生物膜，用于捕捉外源性物质后更有效地运输到靶细胞，经同细胞融合而释放4.2共转染操作步骤第一天：用无抗生素DMEM+10%FBS铺板293FT细胞，2ml/孔确保第二天细胞密度达成80%-90%融合度第二天：1. 500ul 无血清培养基稀释2ug 表示质粒+1.5ug psPAX2+1.5ug pMD2.G 2. 500ul 无血清培养基稀释15ul 脂质体3. 5min后，将DNA溶液和脂质体溶液混合，室温静止20min 4. 从6孔板中吸出1ml无血清培养基，然后滴加入1ml质粒和脂质体混合物5. 6-10h后，移除含有DNA-脂质体复合物培养基，代之以正常培养液DMED+10%FB（以后刻开始算时间）第三天：1.转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达成70%以上第四天：1.转染后48和72h分别收获含病毒上清2.3000 rpm 离心20min，0.45um滤膜过滤，去除细胞沉淀3.1转离心浓缩细胞、分装-80°C贮存4.滴度测定目标基因检定，并出具检测汇报4.3病毒包装原理质粒DNA为能转录出慢病毒遗传物质（RNA），但不能翻译出慢病毒外壳及蛋白成份载体质粒，其同时连有目标基因和汇报基因，psPAX2为能表示慢病毒外壳质粒，其表示产物可经过粘附机制更易穿过细胞膜， pMD2.G为慢病毒膜蛋白质粒，经过 lipofectamine进行三质粒共转到靶细胞基因组中，宿主基因组在表示时，随宿主基因转录出目标基因RNA和psPAX2、pMD2.G基因翻译出蛋白组装为慢病毒。
在上述程序中提及“第四天”搜集病毒在第五天再用该病毒感染靶细胞，病毒进入细胞后，其遗传物质RNA反转录出DNA，该基因再整合到靶细胞基因组中，完成转染过程，因为质粒DNA只能转录出病毒RNA和表示目标基因却不能表示出病毒外壳和膜蛋白成份，所以其不能像一般病毒一样在宿主细胞能反复增殖，故对宿主细胞是无害而且高效将目标基因转然到靶细胞基因组中5、慢病毒感染细胞5.1步骤图5.2感染步骤1）铺板：将对数生长久细胞消化重悬后，按1*105/L密度接种于12孔板，生长过夜2）感染：将70-80%铺满12孔板中培养液吸除，换新鲜培养液，同时加入PBS浓度梯度稀释病毒液，混合均匀后即可放入孵箱培养3) 24h左右可换液，48小时即可看荧光，具体依据细胞状态来看5.3荧光显微镜操作步骤打开荧光器（30min内不能关闭，不然影响显微镜寿命），细胞培养板置于载物台，调整物镜和光圈，先用自然光观察视野内细胞，再关闭光，开启荧光通道，观察荧光强度，判定感染率图片取样前能够调整曝光时间，增益值和彩色度使荧光照片最完美针对leica）5.4注意事项内容1.病毒浓度要适宜，太少话细胞被感染也少，不过病毒浓度太大，对细胞有伤害。
2.感染病毒时培养基量少，以确保病毒浓度，在培养10h左右可依据培养基颜色加培养基3.在不明确细胞感染复数情况下，可进行浓度梯度感染，计算细胞感染复数4.在加病毒后通常24h左右可换液，48小时即可看荧光，具体时间依据细胞状态来看。