脑神康胶囊对培养大鼠海马神经元缺氧复氧损伤的保护作用 【关键词】海马神经元;缺氧复氧损伤;脑神康胶囊;抗氧化;凋亡 氧自由基学说在缺血性脑损伤的机制中占有重要地位，缺血时自由基大量堆积对脑组织产生毒性作用，造成组织器官的构造损伤和功能障碍，导致神经元坏死和凋亡〔1〕有关凋亡机制及抗凋亡药物的中西药开发，一直是国内外研究的热点课题近年来，临床及动物实验采用益气补肾中药治疗脑缺血性疾病，获得了较好的疗效〔2，3〕，但体外实验未见报道本研究旨在体外建立胚胎大鼠海马神经元的缺氧复氧损伤模型，观察益气补肾中药方——脑神康胶囊对其神经元的抗氧化及抗凋亡作用 1材料与方法 1.1动物成年雄性istar大鼠，出生24h之内的istar幼鼠均由山东大学实验动物中心提供大鼠消费答应证号SXK(鲁)20220004 1.2药品及试剂脑神康胶囊由生黄芪、熟地、黄精、川芎、枸杞子、淫羊藿、苍术、野葛根、黄连等组成，由山东大学齐鲁医院制剂室提取制备，每克相当于生药3.564g，用蒸馏水配制成5%水溶液备用胰蛋白酶、多聚赖氨酸、阿糖胞苷、TT均为Siga公司产品，DE/F12培养基由Gib公司消费，胎牛血清由杭州四季青生物工程公司消费，其余为国产分析纯。
超氧化物歧化酶(SD)、乳酸脱氢酶(LDH)及丙二醛(DA)测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品，细胞凋亡检测试剂盒由凯基生物科技开展消费Trizl购自Gib公司，逆转录试剂盒为Ferentas公司产品，所有引物均由上海生工生物工程技术效劳合成 1.3方法 1.3.1含药血清的制备16只成年雄性istar大鼠随机分为二组，第1组按每日给予脑神康10l/kg体重分2次灌胃，第2组给予同等量生理盐水灌胃，每日2次第3天末次给药1.5h后，二组大鼠分别用10%水合氯醛腹腔麻醉，无菌条件下开胸自右心房取血，待凝后3000r/in离心8in，取血清，56℃灭活30in，分装，制备成大鼠正常血清和含药血清，置-20℃备用 1.3.2原代培养及缺氧复氧损伤模型制备出生24h之内的istar幼鼠，无菌条件下别离出双侧海马，剥除脑膜及结缔组织，剪为13的小块，置含有0.125%胰蛋白酶的PBS中，37℃消化15in，参加含10%胎牛血清的DE/F12培养液终止胰蛋白酶的作用，轻轻吹打，使组织分散成单细胞悬液，并经200目不锈钢筛过滤，以1×106/L的密度接种于经0.1g/l多聚赖氨酸处理过的24孔板中，置37℃5%2的培养箱中培养，于接种的第3天参加阿糖胞苷(终浓度为5μg/l)作用24h以抑制胶质细胞的增殖。
取培养第8天的神经细胞用于实验，随机分为对照组、损伤组、脑神康胶囊低、中、高浓度组对照组正常培养，损伤组及脑神康胶囊各浓度组换以无血清培养液，然后置于充以95%N2和5%2的乏氧培养箱内(箱内氧气含量低于1%)，37℃培养6h后取出，损伤组换为含10%正常大鼠血清的DE/F12培养液，脑神康胶囊低、中、高浓度组分别换以含5%、10%、20%含药血清的DE/F12培养液，置37℃5%2培养箱中继续培养24h 1.3.3四甲基偶氮唑盐(TT)代谢率的测定将细胞接种于96孔板，每孔参加20μlTT磷酸缓冲液(终浓度为0.5g/l)，对照孔不作处理，继续培养4h，吸去培养液，每孔参加200μl二甲基亚砜，平行振荡10in，用酶标仪在490n处测定吸光值神经元存活率=实验组光吸收度/对照组孔光吸收度×100% 1.3.6SD、LDH活性及DA含量测定培养完毕后，细胞刮轻轻刮取细胞，超声细胞破碎仪将细胞破碎，按试剂盒说明进展SD活性及DA含量检测取20μl培养液检测LDH活性，操作按试剂盒说明进展 1.4统计学处理实验结果采用SPSS11.5软件分析，数据以x±s表示，两组间计量资料的比拟采用t检验。
2结果 2.1各组海马神经元凋亡率及存活率检测结果见表1与对照组比拟损伤组神经元存活率明显下降，凋亡率明显升高(均P0.01)脑神康胶囊干预后，与损伤组比拟各浓度组神经元存活率上升，凋亡率下降(均P0.01)，且具有剂量依赖性表1各组大鼠海马神经元凋亡率及存活率测定结果比拟转贴于论文联盟.ll. 与对照组比拟：1)P0.05，2)P0.01;与损伤组比拟：3)P0.05，4)P0.01;与中药低浓度组比拟：5)P0.01;与中药中浓度组比拟：6)P0.01;下表同 2.2各组LDH活力损伤组LDH活力为(3851.7±310.6)U/L，较对照组〔(1355.6±128.2)U/L〕明显增加(P0.01)，而脑神康胶囊低、中、高浓度组LDH活力分别为(3136.5±151.6)U/L、(3069.8±189.9)U/L、(2895.4±206.5)U/L，与损伤组相比明显下降(P0.01，P0.05)，且有明显的量效关系 2.3各组SD活性及DA含量见表2损伤组与对照组相比，SD活性明显下降(P0.01)，DA含量显著上升(P0.01)而脑神康胶囊各浓度组与损伤组比拟可进步海马神经元中SD活性(P0.01)，降低DA含量(P0.01)。
其中脑神康胶囊高浓度组可显著降低DA含量，与对照组接近表2各组大鼠海马神经元SD、DA测定结果比拟 3讨论 研究认为，脑缺血再灌注损伤的重要发活力制是自由基学说，该学说认为需氧细胞代谢过程中产生的超氧自由基具有毒害效应，可使神经细胞膜构造破坏，从而引起神经元凋亡和脑组织的损伤〔1，4〕由于脑组织缺血以及再灌注过程中均有大量的氧自由基产生，其中最主要的是DA，因此，测定DA的含量可反映脂质过氧化发生的情况，并可作为判断氧自由基致细胞损伤的指标而SD那么是体内主要的抗氧化酶之一，它能催化超氧阴离子自由基发生歧化反响，阻断自由基的毒性作用而保护细胞免受损害〔5，6〕本研究显示，缺氧复氧损伤后，DA含量比对照组升高，SD活性显著降低;而脑神康胶囊组缺氧复氧后，DA含量与对照组接近，明显低于损伤组，SD活性与正常组接近，明显高于损伤组，提示脑神康胶囊可以显著降低DA含量，进步SD活性，具有明显的抗氧化损伤的作用。
